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应用多聚酶链反应(PCR)技术从中国大陆株日本血吸虫成虫cDNA文库筛选到一编码23kD抗原大亲水区多肽的克隆基因,并把它连接到pGEX载体上进行DNA序列分析和蛋白质表达。结果表明,该克隆基因和编码菲律宾株日本血吸虫23kD抗原大亲水区多肽的克隆基因碱基组成非常相似,193个碱基中只有一个不同,而且这个碱基差异不影响氨基酸序列组成。该重组基因在大肠杆菌里得到高产量表达,而且融合蛋白的纯化很方便。免疫印渍转移试验表明,该融合蛋白能被慢性感染日本血吸虫的小鼠血清、辐照致弱日本血吸虫尾为免疫动物血清、日本血吸虫成虫膜抗原和血吸虫谷腕甘肽转移酶(GST)免疫小鼠血清所识别,具有较强的抗原性。 相似文献
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应用聚合酶链反应(PCR)从中国大陆株日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增到一编码血吸虫副肌球蛋白C端蛋白的DNA克隆,并把该DNA进一步亚克隆到pTrcHisA载体上进行表达。表达产物的分子量为33ku,它和纯化的中国大陆株日本血吸虫成虫副肌球蛋白一样,都能被抗曼氏血吸虫副肌球蛋白的单克隆抗体所识别。说明该重组抗原具有血吸虫副肌球蛋白的抗原性,可被进一步应用于血吸虫病的免疫试验 相似文献
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采用鸟枪法克隆鸡痘病毒(Fowlpoxvirus,FPV)基因组BamHⅠ部分片段,用Thgoxigenin一dUTP标记的FPV282F_4弱毒株BamHⅠ片段探针,点杂交,证实22个克隆插入了FPV282E_4弱毒抹DNA的BamHⅠ片段,选取具有代表性的大小不同的6个质粒pUA、nUB、pUC、pUD、pUE、pUF。6个质粒插入的片段A、B、C、D、E、F分别为7.3,4.9.4.2,3.6,3.2,3.0kb,分别以ClaⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SacⅠ、SmaⅠ、XhoⅠ进行单酶切,又经适当组合酶切。实验结果表明,在各片段在在的单酶切位点为A:EcoRⅠ、SacⅠ、XhⅠ位点;B:EcoRⅠ、XhⅠ、HindⅡ位点;C:ClaⅠ、SacⅠ、SalⅠ位点;D:SalⅠ、PstⅠ位点;E:EcoRV位点;F:EcoRV位点。逃出7.3kb片段,选取片段中单一酶切位点BglⅡ,插入痘苗病毒(vacciniavirus,vv)P_7,5启动于和P_11启动子控制下的报告基因LacZ,构建成时时表达载体质粒,通过与FPV282E_4株转染鸡胚成纤维细胞,一生的重组病毒,可以表 相似文献
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施福恢 沈纬 田锷 叶萍 蔡学忠 钱承贵 林邦发 傅志强 刘金明 石耀军 陈永军 李浩 张正达 吴祥甫 蔡幼民 M.Taylor M.C.Huggins Q.D.Bickle 《中国兽医科学》1997,(11)
1994~1995和1997年应用日本血吸虫3类候选疫苗分别免疫绵羊,各组的减虫率、粪便虫卵减少率和组织(肝、大肠、小肠)的虫卵减少率分别是:虫体副肌球蛋白(n-paramyosin)组17.4%~55.3%,14.6%~68.1%和48.9%~76.7%;重组副肌球蛋白(r-paramyosin)组41.4%~44.2%,15.9%~25.1%和41.1%~48.0%;Sj26谷胱甘肽S转移酶(GST)组53.4%~62.1%,11.0%~38.6%和14.0%~65.0%;rSj28GST组61.4%~68.5%,22.9%~60.0%和39.0%~76.0%;重组日本血吸虫23ku大亲水区表膜蛋白(rSj23)组51.2%~66.1%,21.9%~58.4%和54.3%~76.7%。以ELISA检测免疫后的绵羊血清,3类抗原均诱发高水平的特异性IgG抗体,表明以上疫苗具有诱发绵羊产生保护性免疫的作用。 相似文献
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采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对来自自然感染绵羊脑多头蚴的头节、囊壁可溶性抗原及囊液抗原用垂直平板电泳、连续凝胶系统进行了分析。电泳后以考马斯亮蓝R-250染色。结果:头节抗原共26条多肽带,其分子量范围17.5~148kD,其中主带5条,分别为72、69、46、37和33kD;囊壁抗原共20条多肽带,分子量范围18~126kD,其中主带4条,分别为69、46、29和19kD;囊液抗原共20条多肽带,分子量范围18~162kD,其中主带4条,分别为97、72、57和38kD。初步阐明了羊脑多头蚴三种不同抗原的部分生化特性,为对该抗原的进一步深入研究奠定了基础。 相似文献
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用口蹄疫病毒(FMDV)A型12S基础免疫,O型12S加强免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛迭,得到了一组群特异性单抗。用RPHI,AGD,ELISA及阻断式和竞争式ELISA分析这组单抗得出以下结论:12S抗原至少存在一个12S独有的型间交叉的群特异性抗原表位,该表位是非中和性抗原表位,免疫原性较低;这组群特异性单抗可与FMDVO,A,C,Asia-1型12S发生不同程度的反应,表明该表位存在于FMDVO,A,C,Asia-1型12S上,但不同血清型的12S表位构成存在细微的差别 相似文献
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以PUC19质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)EcoRIDNA文库。根据已经发表的澳大利亚ILTV-SA2株和英国ILTV-V822株的糖蛋白gB基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以ILTV中国王岗株DNA为模板,扩增出1.338kb的糖蛋白gB基因片段,用DIG标记制备成核酸探针,从ILTVEcoRIDNA文库中筛选出阳性重组子,得到一个EcoRI3.0kb的ILTVDNA片段。经酶切分析表明,该3.0kbILTVDNAEcoRI片段含有完整的糖蛋白gB基因,经PCR和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白gB基因是特异的。 相似文献
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将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 分离株BJ2 和BJ4 的ORF 7 及部分3’端非编码区( UTR) 的RTPCR 扩增产物克隆连接于p GEMTeasy 质粒载体上,重组质粒经EcoR Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,BJ2 和BJ4 株与美洲VR2332 株非常接近,在其长度为555 bp 的cDNA 序列中,仅与VR2332 株分别相差1 和2 个核苷酸,其中ORF 7 的核苷酸序列与VR2332 株同源性分别高达100 % 和99 .46 % ,其推导的氨基酸序列与VR2332 株同源性分别为100 % 和99 .25 % ,3’UTR 则完全相同;而与欧洲LV 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为68 .00 % 和67 .00 % ,推测的氨基酸序列同源性仅有65 .00 % 和64 .00 % ,且BJ2 和BJ4 株与LV 株相比缺失了KKSTAPM 和ASQG 两段氨基酸序列,而3’UTR 则比LV 株多出38 nt 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,BJ2 和BJ4 株属于同一基因型,且具有VR2332 株的基因特点 相似文献
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已构建的能表达大肠杆茵耐热性肠毒素1(ST_1)-β-半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株E.coliDH5a(pXST_1)经轧鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体,再辅以氢氧化铝胶制冬抗原,免疫接种BALB/c鼠,获得抗融合蛋白抗体,乳鼠灌胃中和试验结果表明,该抗体能中和天然ST_1肠毒素活性,具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性EALB/c鼠产下的乳鼠吮吸初乳后,能够抵抗1个鼠活性单位ST_1肠毒素的攻击。E.coliDH5a(pXST_1)工程菌株可作为预防大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的侯选菌株。 相似文献
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将体外重组的日本血吸虫中国大陆株28ku谷胱甘肽S转移酶(rSj28GST)与免疫刺激复合物(ISCOM)结合制备了rSj28GSTISCOM。用含85μgrSj28GST的rSj28GSTISCOM及100μgrSj28GST分别免疫BALB/c小白鼠,用常规ELISA检测体液免疫水平,以日本血吸虫中国大陆株尾蚴攻击后的减虫率表示免疫保护力。结果rSj28GSTISCOM免疫组的减虫率为25.5%,其荷虫数和空白对照组荷虫数相比有显著差异,而rSj28GST免疫组的减虫率仅为15.2%,与空白对照组相比差异不显著;ELISA检测结果,rSj28GSTISCOM免疫组比rSj28GST免疫组不仅抗体水平高,而且持续时间长 相似文献
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应用比浊法、可溶性蛋白百分比、夹心ELISA及变性与非变性SDSPAGE等方法来评价猪带绦虫六钩蚴重组抗原的不同复性条件。透析法复性,透析液为含2mol/L尿素,160μmol/LPEG4000,1.0mmol/L0.1mmol/LGSHGSSG的pH9.0的TrisHCl缓冲液,蛋白浓度为2~5mg/mL,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,则免疫活性下降,二聚体、多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上述透析液,蛋白浓度0.1mg/mL,以分步缓慢稀释为佳。透析法复性与稀释法复性最佳条件的实验结果无显著差别。透析法复性的重组蛋白进行Sepharose6FF分子筛凝胶层析,出现2个主峰,收集有免疫活性的第1峰进行DEAESepharose离子交换层析,用含50g/LNaCl、pH9.0的TrisHCl缓冲液洗脱,亦出现2个主峰,收集有免疫活性的第1峰。SDSPAGE显示该峰为单一蛋白条带,蛋白纯度大于90%。夹心ELISA检测免疫活性,每1mg蛋白的效价大于6×105。 相似文献
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提取马立克氏病病毒(MDV)Rispense株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA,运用磷酸钙-DNA沉淀转染CEF,可以成功地得到MDV的病变空斑。用每份沉淀含20μg的MDV和细胞总DNA转染次代CEF,其转染形成空斑的数量为4~221个,转染频率约为10-6~10-5;将磷酸钙-DNA沉淀加入到CEF中,于37℃5%CO2培养箱中培养4h后,室温下用15%甘油休克2min,由此可以提高转染频率约20倍;转染后形成的MDV空斑与原始感染病毒的空斑形态、生长速度一致。MDVDNA通过磷酸钙沉淀法以较高的频率转染CEF,为研究MDV基因组的调控、重组DNA的表达及构建高效基因工程疫苗提供了可靠的技术手段 相似文献
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猪囊虫病基因工程疫苗是预防猪囊虫病的一种新型生物制剂,由猪带绦虫六钩蚴重组抗原与ISCOM基质结合而成,目前已进入区域性试验阶段,有望进一步推广应用。为了适应该疫中图分类号 S858.285.9收稿日期 1999-02-01苗扩大生产及确保生产用菌种的稳定性,我们对SOA工程菌进行52代人工传代和不同条件的保存试验。1 材料与方法1.1 菌种 SOA工程菌由翟春生等(1997)构建,含猪带绦虫六钩蚴保护性抗原基因,原核表达载体pGEX4T2质粒含氨苄青霉素(Amp)抗性和tac启动子,宿主菌… 相似文献
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用醋酸缓冲液和40%饱和硫酸铵连续沉淀法从绵羊棘球蚴囊液(SHCF)中得到部分纯化抗原(SPPCF),并从中分离了抗原A和抗原B,分别用单克隆抗体反向间接血凝试验(M-RPHA)、单克隆抗体双扩散试验(M-DD)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了鉴别,表明自制的三株单克隆抗体(McAb)均识别SHCF、SPPCF及抗原B,而不识别抗原A;用ELISA对阳、阴性血清检测,SPPCF、抗原A和抗原B的阳性检出率分别为83.33%、83.33%和75%,阴性符合率分别为72.22%、86.11%和75%,表明抗原A的敏感性和特异性均优于SPPCF和抗原B。 相似文献