鸡柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株3-1E基因的重组表达及其表达产物的免疫保护性

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力.     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位

克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3);经双酶切和测序鉴定后,将重组菌诱导表达;表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后,免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长549 bp,编码183个氨基酸,预测分子质量为20.3 ku;重组蛋白主要以包涵体形式存在,可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别;在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白,分子质量约为36 ku;EnsHsp2...     

三个柔嫩艾美球虫虫株线粒体cox 1基因部分序列的比较分析

为研究柔嫩艾美球虫不同毒力株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,应用聚合酶链反应扩增柔嫩艾美球虫3个不同毒力株的cox1序列,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫和堆形艾美球虫虫株的相应序列进行比对分析.结果显示,每个虫株都获得659 bp的cox1部分有效序列(pcox1).柔嫩艾美球虫不同虫株的pcox1序列完全相同,但与其他种的艾美球虫相应的pcox1序列有不同程度的差异.表明柔嫩艾美球虫的cox1序列可作为艾美球虫不同种虫株之间遗传变异研究的标记.     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。     

鸡柔嫩艾美球虫子孢子表面抗原基因λMzp5-7在Hela细胞中的表达

将已构建的柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)子孢子表面抗原pMD-Mzp5-7基因片段定向亚克隆到核酸疫苗载体pVAX1上,构建了真核表达载体pVAX-Mzp5-7,酶切鉴定正确后,用脂质体介导的转染法转染Hela细胞,进行了体外表达;并用裸DNA质粒经肌肉接种鸡体内表达。经Western-blotting及RT-PCR鉴定,表明该基因在Hela细胞及鸡体内均获得表达,并有一定的反应原性。     

鸡柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2对其他球虫的交叉保护力

将柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以50μg分别对14日龄和21日龄雏鸡进行胸部肌肉注射免疫,28日龄对各未免疫组与免疫组鸡分别口服接种柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫孢子化卵囊,36日龄剖杀,分析比较免疫保护效果.结果显示,柔嫩艾美球虫攻毒免疫试验组与柔嫩艾美球虫攻毒未免疫对照组比较,增重、盲肠病变记分、OPG值差异显著(P＜0.05),免疫保护效果明显,抗球虫指数(ACI)达186.50;而巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫攻毒免疫试验组的ACI分别为147.85、142.71和153.82,增重、盲肠病变记分、OPG值和ACI与相应的攻毒未免疫对照组比较,均有不同程度改善,免疫保护效果不明显.表明,该DNA疫苗对柔嫩艾美球虫的攻击具有完全免疫保护作用,而对巨型艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫的攻击具有部分交叉保护力.     

利用鸡胚感染测定柔嫩艾美球虫对磺胺喹恶啉和地克珠利的耐药性

将柔嫩艾美球虫鸡胚适应株(保定株)通过每胚注入1000、500和250 μg磺胺喹恶啉及每胚注入5、0.5和0.25μg地克珠利的鸡胚传代.结果,柔嫩艾美球虫鸡胚适应株在注入磺胺喹恶啉500、250μg的鸡胚和注入地克珠利0.5、0.25μg的鸡胚传至第11代时对药物产生了抗药性.     

鸡堆形艾美球虫3-1E基因真核表达质粒的构建及其抗球虫免疫保护作用

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从堆形艾美球虫SH株子孢子中扩增3-1E基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E.质粒纯化后体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术检测3-1E蛋白在转染细胞中的表达情况.将构建的重组质粒以及空载体质粒分别于14、21日龄分2次经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄除非免疫非感染对照组外各组攻击性感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒对球虫感染鸡的免疫保护作用并探讨其免疫保护机理.结果显示,与载体对照组相比,质粒pcDNA3.1(+)-3-1E 2次免疫后可显著提高脾CD8 T淋巴细胞亚型数量,并具有一定的抗球虫免疫保护作用,可显著减少每克粪便的卵囊排出量,降低十二指肠病变记分,减少增重下降等.     

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的盲肠上皮间淋巴细胞表达白介素17的动态变化

以1×104个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊感染10日龄AA肉鸡,于感染后第24、48及72小时分离鸡盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)。提取鸡盲肠IELs总RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-17的表达动态;然后用FITC标记的抗鸡CD4单抗和PE标记的抗小鼠IL-17单抗作为抗体对盲肠IELs进行荧光抗体染色,再进行流式细胞术分析,检测了表达IL-17的CD4+盲肠IELs在柔嫩艾美耳球虫感染后的动态变化。实时荧光定量PCR结果表明,鸡在感染柔嫩艾美耳球虫后能够显著上调IL-17mR-NA的表达水平,流式细胞分析结果表明,在球虫感染后表达IL-17的CD4+细胞数量显著上升。这些结果表明,IL-17参与了宿主抵抗球虫感染的反应。     

黑龙江省哈尔滨地区鸡球虫的区系调查

在哈尔滨地区采用群体采样法分别从6个区218个鸡场采集新鲜粪样,经饱和盐水漂浮法检查,有136个鸡场感染艾美球虫,感染率为62.39%,表明哈尔滨地区鸡球虫感染现象比较普遍.经临床症状及卵囊形态观察,共检出6种艾美球虫,分另q是柔嫩艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫与巨型艾美球虫,其中柔嫩艾美球虫为哈尔滨地区鸡球虫病病原的优势虫种.     

柔嫩艾美球虫杨凌株表面抗原SAG10基因的克隆与原核表达

从柔嫩艾美球虫第二代裂殖子总RNA中扩增EtSAG10基因,与pGEM-T Easy载体连接后转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,扩增不含N端信号肽的编码序列,分别插入表达载体pET-32a( )和pMAL-c2X,转化至E.coliRosetta,以IPTG诱导表达。结果表明,pET-32a( )-EtSAG10在E.coliRosetta中的表达产物约占菌体总蛋白的43%,融合蛋白分子质量约为47 ku,以包涵体形式存在;而pMAL-c2X-EtSAG10在E.coliRosetta中表达的重组蛋白为可溶性,表达产物约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白分子质量约为69 ku。以表达的可溶性EtSAG10重组蛋白100μg/只肌肉注射免疫雏鸡,攻虫后以盲肠病变计分、盲肠卵囊数(OPG)、相对增重率和抗球虫指数(ACI)评价,免疫组相对盲肠卵囊产量为47.7%,抗球虫指数由86.79提高至152.13。提示,重组表达的EtSAG10可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。     

柔嫩艾美球虫感染对鸡体内一氧化氮水平的影响

对33日龄健康罗曼公鸡口服接种1.5×105个柔嫩艾美球虫孢子化卵囊,分别于感染0、2、4、6和8 d扑杀,检测其血清、心、肝、脾、肺和肾组织NO含量.结果表明,试验鸡血清NO水平在感染第4 d显著低于对照鸡(P＜0.05),至感染第8 d显著高于对照鸡(P＜0.05);心、肺NO水平与对照鸡相比差异不显著(P＞0.05);肝NO水平在感染第6 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),其他时间与对照鸡无显著差异(P＞0.05);脾NO)水平在感染第2 d和第8 d均显著低于对照鸡(P＜0.05);肾NO水平在感染第2 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),自第4 d到试验结束与对照鸡相比差异不显著.提示在鸡柔嫩艾美球虫感染过程中NO)可能通过介导机体免疫而参与抗病作用.     

Ea3-1E与mChIL-15融合基因的构建及其真核表达质粒的免疫效果

应用重叠扩增PCR技术将鸡堆形艾美球虫子孢子表面抗原3-1E基因片段(Ea3-1E)与编码鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL-15)进行串联连接,并在这2个基因片段之间引入4个柔性连接肽SPGS,获得融合基因Ea3-1E-linker-mChIL-15。以pcDNA3.1(+)为载体构建并鉴定真核表达质粒pcD-NA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15。应用磷酸钙法将质粒体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。将重组质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15、pcDNA3.1-Ea3-1E和pcDNA3.1分别于14和21日龄经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄时,除非免疫非感染组外,各组感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒的免疫保护效果。结果显示,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后第30小时可检测到融合基因编码蛋白在293T细胞中的瞬时表达。与质粒pcDNA3.1-Ea3-1E相比,质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15二次免疫后可提供明显的抗球虫免疫保护效果,提高相对增重率(96.48%),降低卵囊排出率(68.35%),降低十二指肠病变记分等。抗球虫指数为183.78。     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫SAG4表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫感染鸡动物模型,收集获得柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子,采用PCR扩增柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因不含N端信号肽的编码序列,构建p ET-28a-SAG4表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备SAG4抗血清。用Real-time PCR检测SAG4 m RNA的表达,用Western-blot和免疫荧光技术检测SAG4蛋白的表达情况。结果显示,p ET-28a-SAG4表达的重组蛋白为可溶性蛋白,地克珠利显著降低了柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因m RNA和蛋白的表达。这提示SAG4基因可能与地克珠利抗球虫作用相关,这将为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供理论依据。     

堆型艾美耳球虫早熟系与母株11种抗原基因表达水平的比较分析

应用荧光定量qRT-PCR技术比较堆型艾美耳球虫早熟系及其母株孢子化卵囊的11种抗原基因的表达情况。提取堆型艾美耳球虫早熟系及其母株孢子化卵囊的总RNA,反转录成cDNA,在GenBank中查找堆型艾美耳球虫11种抗原基因并设计相应引物,进行荧光定量qRT-PCR扩增,用熔解曲线、扩增曲线和循环阈值(Ct值)的变化等比较分析堆型艾美耳球虫早熟系及其母株的不同基因的扩增特异性和相对表达量。结果显示,11种抗原基因得到表达;与疫苗母株相比,早熟致弱的疫苗株大部分抗原基因的表达量下降,其中HSP70基因表达量下降明显。结果表明,早熟系毒力的减弱可能与某些抗原基因表达量下降有关。     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利与马杜拉霉素抗药株的基因重组选育

将柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株与马杜拉霉素抗药株等剂量同时感染无球虫鸡,再将得到的杂交后代经饲喂了地克珠利与马杜拉霉素的鸡筛选获得重组体,对该重组体的部分生物学特性进行了研究,旨在采用基因重组方法筛选出具有双重抗性的重组抗药株。结果显示,该重组体的重组率为0.4%;对地克珠利与马杜拉霉素具有完全抗性,而对氯苯胍与尼卡巴嗪完全敏感;卵囊繁殖能力介于两母株之间,致病性与母株无显著性差异。表明,用基因重组法首次成功筛选出了对地克珠利与马杜拉霉素同时具有抗性的柔嫩艾美耳球虫抗药株。     

中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果

采用人工感染发病方法 ,观察了中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果。结果表明 ,10 g/kg禽球灵对柔嫩艾美球虫的感染有较好的预防效果。抗球虫指数 (ACI)达 15 1.4 8,血便分数较感染不给药组降低了 4 8.2 2 % ,料肉比较感染不给药组降低了 2 6 .2 9%。     

斯氏艾美耳球虫泛素结合酶重组蛋白对家兔免疫保护效果的评价

观察斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai）重组蛋白r Es-UCE、r Es-EFG和r Es-DG32对家兔的免疫保护效果。利用相对荧光定量PCR分析Es-UCE、Es-EFG和Es-DG32 3个基因在虫体不同发育时期的转录水平并进行原核表达与蛋白纯化。在进行了3个重组蛋白对家兔的免疫保护效果初步试验后,筛选出r Es-UCE进行进一步评价,将42只45日龄无球虫家兔分为空白对照组、攻虫对照组、空载蛋白对照组、佐剂对照组和r Es-UCE免疫组,各组分别颈部皮下注射1 m L无菌PBS,1 m L无菌PBS,1 m L(2 mg/m L)皂素,1 m L(100μg/m L)Trx-His-S tag蛋白,1 m L(100μg/m L)r Es-UCE,14 d后同等剂量进行二免。二免后第14天攻虫,除空白对照组外每只无球虫兔经口感染1×104个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊。感染后定期观察各组兔的临床症状、称重并采血,感染后第21天剖检并收集直肠粪样,测定并统计各组兔的死亡率、卵囊排出量、相对增重率、料肉比、肝指数、血清种特异性抗体与细胞因子等。结果显示,试验各组均未出现死...     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位