猪带绦虫烯醇化酶基因的原核表达及鉴定

为了探索猪带绦虫烯醇化酶基因的生物学功能,以猪带绦虫幼虫cDNA为模板,PCR扩增获得烯醇化酶基因的ORF,并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒。经IPTG诱导表达后,纯化表达产物,采用免疫印迹法分析表达产物的免疫反应性,并测定它与纤溶酶原的结合特性及酶活力。结果显示,该基因的ORF大小为1 302bp,表达大小约为53ku的重组蛋白;表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清识别;该重组蛋白具有纤溶酶原结合特性及酶活力。据此推测,猪带绦虫烯醇化酶可能在寄生虫入侵宿主过程中发挥作用,有作为药物靶标或疫苗候选分子的潜力。     

猪戊型肝炎病毒ORF2 C-端主要抗原区的克隆及原核表达

为研究猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2C-端主要抗原区的原核表达产物是否具有抗原性,用PCR技术对猪戊型肝炎病毒ORF2C-端基因进行扩增,经克隆与序列分析,发现该基因片段编码289个氨基酸残基。将该目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,转化表达菌BL21(DE3),成功构建了重组质粒pET-HEV-ORF2-C,其重组菌于37℃、0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后,菌体裂解物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为34ku处出现一新蛋白带,与预期的目的蛋白分子质量相符。质谱鉴定表明,成功地表达了HEV-ORF2C-端蛋白。Western-blot和抗体效价检测分析结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性。     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

基于ORF3蛋白的PCV2间接ELISA诊断方法的建立

ORF3蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type,2PCV2)的一个重要的非结构蛋白。根据GenBank数据库中PCV2的ORF3基因序列设计引物,以PCV2基因组为模板进行PCR扩增,并构建重组表达质粒。将重组质粒转染至BL21感受态细胞,进行最佳诱导条件的选择,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组ORF3蛋白作为酶标包被抗原,优化反应条件,建立PCV2间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)诊断方法。结果显示,重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定构建成功。重组蛋白表达的最佳诱导条件为37℃、8 h、1 mmol/LIPTG。Western-blot结果表明,该重组蛋白具有较好的免疫原性。Ni-NTA亲和层析纯化结果表明,280 mmol/L咪唑为最佳洗脱浓度。iELISA的最佳包被抗原质量浓度为0.03 mg/m L,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳工作浓度为1∶4 000。批内和批间试验结果表明,该方法具有较好的重复性。此iELISA与PCR检测方法具有良好的一致性。结果表明,基于ORF3蛋白建立的PCV2间接ELISA诊断方法,可以为临床上rCap蛋白基因工程疫苗免疫猪场进行鉴别诊断。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3''端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

猪圆环病毒2型ORF2基因的优化表达及活性检测

通过软件分析后,截去猪圆环病毒2型ORF2基因中影响蛋白表达的保守基因,并对其余的基因进行了密码子优化。把改造后的ORF2基因连接到pGEX-4T-1载体上并转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出分子质量为50ku的重组蛋白,在0.2mmol/L的IPTG诱导5h情况下表达效果最好,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经琼脂糖凝胶纯化可得到较纯的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能刺激小鼠产生相应抗体,并能与PCV2阳性血清进行特异性免疫印迹反应。试验结果证实表达的蛋白具有良好的抗原性。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

论伊斯兰政治文化功能(下)

伊斯兰政治文化与法律密切相关,两者相辅相成.政治文化中包括法文化,其内容主要包括:<古兰经>立法、教法、民法和刑法等.在一定程度上,伊斯兰教法是对政治文化的有力支撑.伊斯兰政治文化思想首先源于<古兰经>,贯穿于民法、刑法等诸法律中.认主独一、服从真主和使者,成为宗教信仰与政治文化一元论的政治观,构成了伊斯兰政治文化的基础、核心和主导思想.伊斯兰文化与政治、宗教、宗教观念相通,尤其是认主独一的信念具有突出的宗教内容.在当代伊斯兰文化整合与重建中,<古兰经>和圣训居核心文化地位,公议和类比作为法律补充.伊斯兰教的政治力与当代伊斯兰运动有渊源关系,在多数情况下,一经民主选举,伊斯兰势力就能获得成功,并有多米诺骨牌的效应.     

伊斯兰主义向何处去?(下)

九一一事件后,美国在全球范围内展开了一场反对恐怖主义的战争,并先后用武力推翻两个穆斯林国家的合法政权,不仅如此,美国还在伊斯兰世界推行民主变革,以铲除伊斯兰极端主义滋生的土壤。人们总是小心翼翼地避免把反恐战争描绘成不同文明之间的冲突。然而,无庸讳言,九一一事件和反恐战争还是将西方(美国)与伊斯兰世界、基督教与穆斯林等具有强烈对比的话题摆在了人们面前。本文力图以历史唯物主义为指导,通过分析伊斯兰主义的发生与发展历史,对当代伊斯兰主义的未来发展趋势做出判断。与以往的研究类似,笔者坚持把伊斯兰主义的研究建立在3个纬度之上,即伊斯兰主义与西方世界的关系、伊斯兰社会内部的变化、伊斯兰教的内部特点。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

日美"2+2"会议文件与日美同盟转型

2007年5月,日美举行外长与防长"2 2"会议,发表《同盟的变革:日美安全及防卫合作进展》共同文件。该文件赋予日美同盟新的内涵,确认了几年来同盟转型的成果,详细说明了日美如何联合运用导弹防御系统为"提高整体威慑力"服务,并指明同盟的未来方向及重点。其中还有部分表述涉及中国,由此可以预料,该共同文件的落实必将对中国产生影响。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

中国与南非建交的战略选择(下)

在全球一体化和发展多元化的形势下,发展中大国之间的协调与合作,对世界经济和政治秩序的建设正起到不容忽视的作用。中国与南非合作关系的发展证明了这一点。中南建交近十年来,共识与合作不断深化,两国正在形成政治互信、经济互利、国际互助的战略伙伴关系。双方从增进了解到加深理解,对各自国家治理的政策理念和国际事务中对发展中国家的利益诉求有广泛的共同立场与合作的基础,也建立了卓有成效的协商机制。今后的中南关系将进一步走向成熟和稳定。     

评析2011年度美日“2＋2”会议

2011年6月21日，美日两国外交部长和国防部长在华盛顿举行了新一轮安全保障协商委员会会议（简称“2＋2”会议）。会议制定了新的美日共同战略目标，突出共同应对所谓“中国威胁”，讨论了加强美日同盟的新措施并达成协议。美日双方对本次会议都十分重视。2011年正值美日同盟成立50周年。更重要的是，因为2009年9月日本民主党执政后，时任首相鸠山由纪夫提出“对等的日美关系”、“东亚共同体”等政策，被认为是“疏远美国”的政策，令美国颇为不满。日美关系缓和后，双方都希望能有一次高级别会议结束过去一段不愉快的插曲，使日美关系能回到以往亲密无间的友好状态，巩固和加强美日同盟。