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21.
参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性. 相似文献
22.
利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。 相似文献
24.
为获得针对猪带绦虫六钩蚴(TSO)45W-4BX抗原的杂交瘤细胞株,用IPTG对TS045W-4BX的重组质粒pGEX-4BX进行了诱导表达,并采用Sepharose-4B层析技术对表达产物进行纯化,运用SDS-PAGE和Western-blot分别对其纯度和活性进行了检测.分别用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化已纯化的猪带绦虫TS045W-4BX重组抗原,随后用其分别免疫BALB/c小鼠3次,检测血清抗体效价呈阳性.之后,再进行加强免疫,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合,经TS045W-4BX抗原和GST抗原双系统间接ELISA筛选,最终获得了18株抗TS045W-4BX抗原的杂交瘤细胞株.采用有限稀释法对其中的4株进行5次亚克隆,最终获取了4株稳定分泌针对TS045W-4BX抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,金标试纸条法鉴定其抗体亚类均属于IgG1类,轻链为κ型. 相似文献
25.
采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株与广西分离株R2σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS。构建好的重组质粒经37℃1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%~34.8%。Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性。 相似文献
26.
27.
鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF.采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamH Ⅰ Hind Ⅲ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性.结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白.DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近. 相似文献
28.
猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性 总被引:1,自引:0,他引:1
应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性. 相似文献
29.
从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白. 相似文献
30.
“时光将我们的人生做了最精确的计算,历史为我们的付出做了最详实的见证。春华秋实,在这吉祥的日子里,我无法抑制地再次回望来时的路,那上面分明印满我汗水和泪水凝结成的艰苦创业、奋力拼搏的足迹。”这是经商和写作都堪称才女的林林所著的书的自序开头语,了解了她的创业与成功之路才更深刻地理解了这段话。 相似文献