MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

延边地区牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查

为了解吉林省延边地区牛瑟氏泰勒虫病的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对采自延边地区的206份牛血液样本进行了牛瑟氏泰勒虫病的分子流行病学调查。结果显示,PCR检测的阳性率为62.6%,显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率(17.5%)。采用统计学分析方法对PCR检测的206份血液样本进行了不同地区、不同年龄、不同品种及饲养方式的比较;结果,不同地区之间和不同品种之间瑟氏泰勒虫感染率差异不显著(P>0.05);而不同年龄阶段之间和不同饲养方式之间牛瑟氏泰勒虫感染率差异显著(P<0.05)。结果表明,吉林省延边地区是牛瑟氏泰勒虫病的流行地区。     

15个常染色体和18个Y染色体STR基因座复合扩增检测体系及法医学应用

目的建立15个常染色体和18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的六色荧光标记复合PCR直扩检测体系,并评估其法医学应用价值。方法采用六色荧光标记技术,建立15个常染色体STR基因座(D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、v WA、D21S11、D18S51、D8S1179、D5S818、FGA)和18个Y染色体STR基因座(DYS527a/b、DYS448、DYS456、DYS385a/b、DYS458、DYS391、DYS390、DYS19、DYS438、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA、DYS635)以及Amelogenin的复合扩增体系,收集800份无关人员血样进行基因座检测,评估所建复合扩增体系的稳定性、灵敏度、种属特异性、直扩可行性以及抗抑制性。结果本检测体系对800份无关人员血样复合扩增后,结果准确,灵敏度达0.125ng;种属特异性高;38份案件检材全部准确分型。在对照男性与女性的DNA浓度比值大于等于1:4时,男性DNA的所有基因座均能准确分型。若模板DNA中含一定浓度的已知抑制剂时,所有基因座也均准确分型。结论本文建立的复合扩增检测体系可同时检测15个常染色体和18个Y染色体基因座以及性别基因座,结果稳定准确,灵敏度高,可为法医DNA检测分析提供一个新选择。     

宁波甬江水域夏冬季节溺死兔内脏硅藻16SrDNA的鉴定

目的采用PCR法检测夏季7月和冬季12月宁波甬江水域溺死家兔内脏组织中硅藻16SrDNA,评估其在夏季7月和冬季12月溺死鉴定中的应用价值。方法于夏季7月和冬季12月分别选取30只大白兔,总计60只大白兔,随机分为溺死组(n=10)、死后入水组(n=10)、空气栓塞组(n=10)。各组分别提取心、肝、肺、肾组织,应用PCR技术检测上述兔内脏硅藻16SrDNA。结果与死后入水组比较,夏季7月兔溺死组心、肝、肺、肾组织中硅藻16SrDNA检出率明显增高(P<0.05);而冬季12月溺死组仅心、肺组织中检见硅藻16SrDNA,与死后入水组比较无明显差异(P>0.05);夏季7月溺死兔组心、肝、肺、肾组织中硅藻16SrDNA检出率明显高于冬季季12月溺死兔组(P<0.05);夏季7月和冬季12月空气栓塞组心、肝、肺、肾组织中硅藻16SrDNA均未检出。结论宁波甬江水域夏季溺死兔中硅藻16SrDNA检出率高,PCR技术可用于溺死诊断;而冬季硅藻16SrDNA检出率低,运用该技术诊断溺死应慎重。     

靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定

为探讨绵羊内源性反转录病毒(enJSRV)在绵羊胚胎发育过程中的作用,利用脂质体将pEGFP-C1空载体转入绵羊绒毛膜滋养层细胞中,测定其转染效率。同时构建抑制enJSRV env基因的RNA干扰质粒,并将其转染到能稳定表达enJSRV env基因的绵羊绒毛膜滋养层细胞中,通过荧光定量PCR检测其干扰效率。结果显示,重组干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1、enJRSV-env-shRNA-2、enJRSV-env-shRNA-3、enJRSV-env-shRNA-4、Negative-shRNA构建成功。Lipofectamine LTX脂质体体积为6.0μL,转染混合物体积为100μL,转染48h组的转染效率最高,为42.37%。与正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量相比,转染靶基因干扰质粒的各组绵羊绒毛膜滋养层细胞中enJSRV-env mRNA表达量分别下调了73.56%、66.82%、33.66%和18.16%。筛选出了一个干扰效率最高的RNA干扰质粒enJRSV-env-shR-NA-1,为以后包装慢病毒及进行动物试验来揭示enJSRV的生殖生物学作用奠定了坚实的基础。     

微量血痕中18SrRNA与ACTBmRNA变化的时间规律性研究

制备不同时间的血痕样品,采用实时定量PCR检测不同时间点18SrRNA和ACTB mRNA含量,并进行统计学分析。结果发现在10周内,随血痕经过时间延长,18SrRNA基因片段和ACTBmRNA基因片段发生了较明显降解,具有一定的时间规律性。18SrRNA基因片段较ACTB mRNA降解速度快。采用实时定量PCR技术检测18SrRNA和ACTBmRNA含量变化,为推断血痕经过时间提供了新的方法和客观依据。     

一种用于降解DNA样本的性别鉴定方法

目的 建立一种采用PCR技术对降解DNA样本进行性别鉴定的新方法。方法 采用针对amelogenin基因X染色体外显子3bp缺失设计的引物AMELU1及AMELD1,对在室温环境下放置5－15年的男、女血痕标本各50例、毛发各20例、骨骼各20例以及现场提取5－－20天的男、女腐败肌肉各10例标本中提取的降解DNA样本进行扩增。用PGA（9％T,3％C）电泳、银染显带检测扩增产物。结果 所有样本均得到正确结果,男性检材表现为83bp的Y特异性及80bp的X特异性2条谱带,而女性检材仅有1条80bp的X特异性谱带。结论 用针对amelogenin基因X染色体外显子3bp缺失设计的引物AMELU1及AMELD1鉴定性别的方法灵敏、可靠、方便,是降解DNA检材性别鉴定十分理想的方法。     

191名白山市汉族CODIS系统9个STR位点群体遗传学调查

目的：白山汉族CODIS系统9个STR位点基因频率调查及其法医学应用;方法：实验样本从191位无相关白山市汉族个体获取,采用PCR复合扩增及310遗传分析仪自动基因分型;结果：这9个STR位点均为高识别率位点,同重庆汉族人群群体遗传学数据比较显示有显著性差异;结论：基因频率适合于白山汉族人群同一性概率及亲子鉴定概率计算;中国南北方汉族在个体识别及亲子鉴定概率计算时应采用本民族自己的等位基因频率。     

复合扩增检测D9S302、D18S865和PLA2A基因座多态性

应用 PCR复合扩增技术、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显色检测技术,对云南省汉族人群 100名个体的 D9S302、 D18S865和 PLA2A基因座进行了研究,分别检出 10、 7和 7个等位基因,基因型频率分布均符合 Hardy－ Weinberg平衡,家系调查证实三基因座的传递遵循孟德尔遗传规律。三基因座累积个人识别率为 0.999 7,累积非父排除率为 0.992 9。证实了复合扩增 D9S302、 D18S865和 PLA2A三基因座是法医学个人识别和亲权鉴定中极有价值的检测方法。     

生物素掺入反向杂交法在法医学中应用的研究

建立了一套快速、准确检测人类 HLA－ DQA基因的反向杂交检测技术,可准确判定 HLA－ DQA基因位点的 6个等位基因即 0101、 0102、 0103、 0201、 0301、 0401。调查了中国北方汉族人群中 200例无关个体的 HLA－ DQA基因频率及基因型的频率分布,杂合度 (H)为 0.75,个体识别能力 (DP)为 0.928。采用生物素直接掺入 PCR扩增的方法, 1ng的 DNA样品即可准确判型。对血液、血斑、精斑、精液与阴道液的混合斑、肌肉组织等检材进行检测,效果良好。在刑事案件及亲子关系鉴定中应用,准确地判定了检材的 HLA－ DQA基因型,为侦察破案提供了科学依据。将此项技术商品化,完成了试剂盒的研制。