含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

BHK-21细胞蛋白样品双向凝胶电泳条件的优化

分别从BHK-21细胞处理方法、样品上样量、聚丙烯酰胺凝胶浓度和染色方法4个方面优化了BHK-21细胞蛋白双向凝胶电泳的技术条件,以为口蹄疫病毒感染细胞比较蛋白质组学研究奠定基础。结果表明,处理细胞时,采用超声破碎方法优于反复冻融方法;用考马斯亮蓝染色时,7cm胶条上样量为100μg时图谱的蛋白点较多且分离清晰;浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶所得的蛋白点较多;通过2种染色方法的比较,硝酸银染色方法优于考马斯亮蓝染色方法。优化后的双向凝胶电泳技术得到的图谱,蛋白点多且清晰,重复性好,拖尾现象减少,符合软件分析的要求,可用于口蹄疫病毒感染BHK-21细胞蛋白质组学研究。     

山羊痘病毒的鉴定及序列分析

以华中地区某山羊场疑似山羊痘病料为对象,进行了本动物病例复制、透射电镜观察、病理切片HE染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果,复制了山羊痘本动物模型,观察到山羊痘病毒(GTPV)样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,病料中扩增到P32基因;序列测定及遗传分析表明,该病毒为山羊痘病毒(ZL/HB/HN),与2008年分离于印度的山羊痘毒株(FJ748488)的遗传关系最近,与中国山羊痘疫苗株(AY881707)及1978年分离于印度的山羊毒株(AY382869)同属一个进化分支。     

口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白对豚鼠CD8~+T细胞应答的免疫增强作用

为了整体评价口蹄疫病毒非结构蛋白和前导蛋白对免疫应答的影响,选用反向遗传操作技术构建的与野生型毒株(Mya98/BY/2010)P1基因相同而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒(分别被命名为Re-Mya98/BY/2010)和Mya98/BY/2010)作为抗原,经BEI灭活后与4种佐剂乳化,制备不同的疫苗作为免疫原。然后免疫豚鼠,利用流式细胞仪检测免疫豚鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的含量,ELISA方法检测免疫豚鼠血清中抗体应答。免疫后第28天进行攻毒试验。结果,抗原剂量相同的条件下,重组Re-Mya98/BY/2010疫苗比Mya98/BY/2010疫苗更能有效诱导CD8+亚群,每个时间点都含有较高的含量。ELISA结果显示,Mya98/BY/2010和Re-Mya98/BY/2010抗原都能诱导抗体应答,早期Re-Mya98/BY/2010诱导更高的抗体应答。豚鼠攻毒后,免疫Re-Mya98/BY/2010疫苗的保护率分别达到100%、83.33%、100%和50%,而免疫Mya98/BY/2010疫苗的保护率仅为20%、0、17%和25%,两者具有明显的统计学差异。结果表明,口蹄疫非结构蛋白在诱导免疫应答方面具有显著的诱导CD8+T淋巴细胞应答和提高免疫保护率的作用。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A的研究进展

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种最具影响、最难控制的动物疫病之一,严重危害着偶蹄动物的健康。FMDV属于单股正链RNA病毒,由结构蛋白和非结构蛋白组成。本文系统总结了口蹄疫病毒非结构蛋白3A的结构和功能特点,有助于进一步研究FMDV的感染机制并为FMD防控提供参考。     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

猪急性腹泻综合征冠状病毒膜蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗膜蛋白(M)多克隆抗体,本研究以SADS-CoV GDS04分离株cDNA为模板扩增M基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒pGEX-6p-1-M.测序正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,所获得的重组...