堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68 ku重组Bm86蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32%以上,诱导96 h目的蛋白的表达量为0.36 mg/mL。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,利用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17 ku大小的分泌性目的蛋白,采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化,纯化结果理想。     

猪带绦虫TSO18基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEMTSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接,构建重组表达载体pPIC9kTSO18,转化大肠埃希氏菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9kTSO18,用SalⅠ线性化,并电转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株,以甲醇进行诱导表达,SDSPAGE和Westernblotting分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80%以上,诱导72h目的蛋白表达量为0.5mg/mL。     

猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因在毕赤酵母中的表达

采用RT-PCR方法从猪囊尾蚴总RNA中扩增出TsCL-1基因并构建了真核表达载体pPIC9K-TsCL-1,pPIC9K-TsCL-1电转化毕赤酵母GS115.采用G418抗性梯度筛选多拷贝重组菌株,经甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达情况.结果显示,TsCL-1与GenBank登录的TsCL的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.8%和100%,与肝片吸虫和大片吸虫组织蛋白酶氨基酸的同源性为76.3%.TsCL-1基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物的分子质量为42 ku左右;Western-blot分析表明,表达产物具有反应原性.     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒 (Foot and mouthdiseasevirus ,FMDV)RNA聚合酶基因 3D为研究对象 ,对其部分碱基进行定点诱变 ,替换成在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切 ,然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接 ,构建重组表达载体 pPIC9K/ 3D ,转化大肠埃希氏菌JM 10 9,筛选阳性克隆pPIC9K/ 3D。经测序表明 ,插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化 ,电转化毕赤酵母SMD116 8,采用G4 18抗性梯度法筛选 ,获得高拷贝整合重组菌株SMD116 8/ pPIC9K/ 3DHIS MUT ,利用甲醇进行诱导分泌表达 ,经SDS PAGE和Westernblot ting鉴定 ,3D基因在毕赤酵母中表达成功 ,目的蛋白分子质量大小为 5 2ku ,与预期的大小吻合 ,并能够被FMDV阳性血清所识别 ,表达量占总分泌蛋白量的 36 %。     

黑龙江省双城市绵羊寄生虫区系调查

解剖绵羊 69只 ,在 5 4只绵羊体检获寄生虫 2 4种 ,其中吸虫 6种 ,绦虫 (包括绦虫蚴 ) 6种 ,线虫 8种 ,羊狂蝇 1种 ,以及硬蜱、疥螨和球虫。当地的优势种是捻转血矛线虫、羊仰口线虫、哥伦比亚食道口线虫、粗纹食道口线虫、蛇形毛圆线虫、绵羊毛首线虫、肝片形吸虫、胰阔盘吸虫、前后盘吸虫、贝氏莫尼茨绦虫、羊狂蝇幼虫。腔阔盘吸虫、棘球蚴、丝状网尾线虫、硬蜱和疥螨为双城市首见虫种。丝状网尾线虫是黑龙江省绵羊寄生虫的新记录     

广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查

对广东省 10个奶牛场进行了隐孢子虫病的流行病学调查 ,并按大致 10 %的采样率采集了 10 87头乳牛的新鲜粪便 ,以饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法检查隐孢子虫卵囊 ,其中检出卵囊的阳性牛 92头 ,阳性率为 8.4 6 % ;有 7个场检出隐孢子虫卵囊 ,场阳性率为 70 %。这 7个奶牛场的卵囊阳性检出率分别是 10 .0 0 %、7.19%、6 .6 7%、9.80 %、6 .72 %、12 .76 %和 6 .72 %。调查发现 ,乳牛隐孢子虫的阳性率和感染强度与乳牛年龄呈负相关关系 ,而且可能与气候有关 ;所检出的隐孢子虫卵囊经形态学鉴定为鼠隐孢子虫 (Cryptosporidiummuris)。     

缅甸：2009年回顾与2010年展望

2009年缅甸政局基本稳定,虽然爆发了世人瞩目的果敢事件,但对少数民族地方武装（民地武）的改编仍取得部分成功,此外,政府与反对党以及昂山素季的关系有所缓和。经济上,缅甸没有受到国际金融危机的严重影响,物价和币值都保持了稳定。外交上,以美国为首的西方国家虽然没有取消对缅甸的制裁,但是开始与缅甸进行接触。展望2010年,“民地武”的改编与大选是对缅甸政府的严峻挑战。     

罗易在印度世俗化进程中的作用

西方的以科学、理性、民主、平等为核心的启蒙思想在印度的深入传播,引发了印度的一场实质上的世俗化运动。罗易的思想与活动不但对这场运动具有重要的开路、创始之功,而且在很大的程度上规定着以后的印度世俗化进程的总的方向和基本原则。考察印度世俗化的起点,将有助于我们真切地把握今日印度世俗化进程的可能性与走向。     

2008年缅甸形势综述

2008年,缅甸局势总体上保持了稳定,特别是在遭受数百年不遇的"纳尔吉斯"(Nargis)风灾后,面对国际社会的巨大压力,缅甸政府继续按原计划举行了新宪法的全民公投,并以高票获得通过,表明由军人执政的缅甸政府对国内政局的控制力仍是不可动摇的.在经济方面,由于风灾和全球性金融危机的影响,2008年缅甸经济发展态势明显不如2007年,但仍有一些亮点.在对外关系方面,缅甸继续保持了与印度、东盟和中国的友好关系,两方国家对缅甸政策没有实质的改变.     

2008年初肯尼亚政治危机反思

2008年初,肯尼亚政治危机的导火线是奥廷加及其领导的"橙色民主运动"对总统选举结果强烈不满.当年的"全国彩色同盟"解体,分裂为"全国团结党"和"橙运"两大派,是双方矛盾不可调和的结果.奥廷加的崛起除得益于肯尼亚盛行的族性政治外,同他的改革派面貌和建立小族--地区联合阵线的主张与宣传活动有关.这次危机的解决和大联合政府的成立归因于来自国内外的巨大压力.非盟和前联合国秘书长科菲·安南发挥了关键性的调停作用.大联合政府面临宪法改革、土改等诸多问题,但双方为了各自的既得利益,取得进一步的妥协是可能的.     

印尼经济2003年回顾和2004年展望

2003年印尼宏观经济稳定,国内经济取得小幅增长,经济增长的动力主要来自消费,出口和投资对经济增长贡献有限。如果印尼大选能顺利完成,2004年印尼经济增长幅度可达到4-5%,估计要到2006-2007年印尼经济才能达到危机前的增长水平。     

逆全球化背景下东亚经济合作的机遇

亚洲金融危机推动了东亚合作的机制化建设,经过了20年的发展,本地区逐渐形成了以东盟为主导、"10+3"为核心、东亚峰会为主要平台的多层次合作框架。本文基于中日两国对掌握东亚合作主导权博弈的视角,回顾了在域外因素影响下的中日韩东亚政策演变。本文认为当前东亚地区的合作困境源于本地区仍然存在的冷战对抗思维与零和博弈认知,而逆全球化给各国带来冲击的同时也提供了合作契机。中日韩应积极重启领导人对话机制,以互惠的经济关系和共同的和平诉求为合作基点,加快区域经济合作安排的谈判,利用边境自贸试验区的建设等途径,尽快在经济合作领域取得阶段性成果。     

乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定

在血清学调查的基础上,进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定。取新孢子虫血清抗体阳性乳牛的流产胎牛的脑、心、肺、脾、肝等组织进行病理学检查,经HE染色观察到脑组织中存在类似于新孢子虫包囊样结构,经免疫组织化学染色排除刚地弓形虫包囊的存在,确认该包囊为新孢子虫包囊。同时提取流产胎牛脑组织DNA,应用新孢子虫特异性引物Np6/Np21进行PCR扩增,扩增出的特异性目的条带的序列与新孢子虫标准株Nc-1的gene 5序列的一致性为98%。首次证实我国大陆流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。     

贵州省3地(市)牛寄生虫调查

1997年,在贵州省遵义、毕节、铜仁3地(市)、9县开展了牛寄生虫病调查,共检查粪样9000份,检获虫卵、幼虫16种,牛寄生虫感染率这100%;剖检牛270头,其中黄牛170头,水牛100头;检获各类寄生虫虫体65种,其中吸虫31种,绦虫3种,线虫19种,蜘蛛昆虫7种,原虫5种,分别隶属于7纲、14个目、25个科、38个属.