家畜重要支原体病疫苗的研究进展

综述了山羊传染性胸膜肺炎、传染性无乳症、猪支原体肺炎、牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病等几种重要的家畜支原体疾病疫苗的优点、缺点、研究进展以及应用情况,展望了利用基因工程技术开发有关新型疫苗的前景,旨在为研制新型家畜支原体疾病疫苗、减少其对家畜养殖带来的损失提供思路。     

规模化猪场生产母猪心力衰竭的病理学观察

为探究生产母猪心力衰竭(heart failure)的病理变化和组织学特征,对广西某规模化猪场45头死亡生产母猪进行了临床症状观察、大体解剖和组织病理学检查。结果,其中18头病猪临床症状表现为易疲劳,精神沉郁,呼吸困难,夜间咳嗽和突然死亡;剖检可见心包严重黏连或心室扩张、心包积液、心肌出血、心脏横径与纵径之比增大,以及肝、脾、肺、肾的淤血肿胀;组织病理学变化表现为心肌肿胀变性或萎缩坏死,纤维素性肺炎、间质性肺炎、化脓性肺炎和支气管肺炎,以及多个器官的淤血。结果表明,心力衰竭为母猪突然死亡的重要原因,其主要病理学特征为心室扩张或心包粘连,心肌肿胀坏死、心肌纤维化并伴随多器官淤血病变。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

牛传染性鼻气管炎病理形态学的研究

牛传染性鼻气管炎早在欧洲、北美洲、澳洲和新西兰等国发生,并屡有报道。我们对本病的病理学进行了研究。其结果报道如后。(一)肉眼观察 病牛营养中等,两眼失明,右眼角膜处覆盖有约成人拇指头大较厚的灰色翳斑;左眼同上变化,但翳斑呈灰白色似较薄于右眼翳斑。眼结膜潮红,鼻腔、鼻甲以及中隔粘膜均呈显著潮红充血,下鼻甲粘膜表面发现有多数小而浅形的溃疡灶,特别是在小溃疡多数密集的地方呈虫蚀样的外观。齿龈和舌底两侧面粘膜上也有为数不多的浅形溃疡散在。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。     

家兔肾母细胞瘤的病理学观察

肾母细胞瘤或称为成肾细胞瘤,是一种来源于胚胎组织的恶性肿瘤,主要发生于未成年的兔、鸡、猪、犬和牛。有关家兔肾母细胞瘤的病理学虽有记载,但关于肠、肝、肠系膜淋巴结继发肾母细胞瘤的报道甚少。我们自1985年以来共收集10例家兔肾母细胞瘤的自然病例,进行了病理学观察,现总结报告于后。     

注射用头孢噻呋钠对靶动物牛的安全性试验

头孢噻呋钠是一种专门用于动物的第三代头孢菌素类抗生素,目前国内暂无对头孢噻呋钠在靶动物牛的安全性相关研究。为了评价该制剂对靶动物牛的安全性和剂量相关的毒性反应,确定合理的安全范围。本试验遴选32头健康牛,随机分为4组,每组8头,设0倍剂量组(空白组)、1倍剂量组、3倍剂量组、5倍剂量组。牛颈部肌肉注射给药,连续9 d,每日1次。试验期间,每日观察牛临床表现及不良反应,记录并分析试验前后牛的体重变化,对试验前后采集所有实验牛的血液和尿液进行检测分析,对5倍剂量组和空白组部分牛实施安乐死进行组织病理学检查。结果显示,各剂量组牛的采食、饮水、呼吸频率、心率以及精神状态正常,均未观察到与头孢噻呋钠相关的临床变化,粪尿排泄均正常,未有异常表现。与空白组相比,注射用头孢噻呋钠各剂量组牛给药前后体重差异均不显著;血液学检查和血清生化学指标以及尿液指标差异均不显著;大体剖检未有显著的病理变化;与空白组相比,5倍剂量组牛的组织病理学检查也未发现显著的病理变化。每日1次,连续9 d使用5倍推荐剂量的注射用头孢噻呋钠,靶动物牛仍耐受,故注射用头孢噻呋钠在临床使用中具有良好的安全性。     

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)在支原体培养中的应用研究

为了分析细菌培养指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)在支原体培养中的应用,笔者将牛支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体、鸡毒支原体、肺炎支原体分别接种于含有TTC的改良Thiaucourt’s液体培养基(TTC-MTB)和改良Thiaucourt’s固体培养基(TTC-MTA)中,同时以常规酚红指示剂培养基作为对照,观察支原体在2种培养基中的生长情况,并筛选TTC在培养基中的最适指示浓度。结果显示,与常规酚红指示剂相比较,TTC有更为灵敏的培养指示效果;在固体培养基中,TTC指示的支原体红色菌落更有利于菌落的计数及形态的观察;TTC的最佳使用浓度为0.2 mg/mL。本研究可为支原体培养和优化疫苗生产工艺提供参考。     

绵羊肺炎支原体免疫组织化学及间接免疫荧光检测方法的建立

以病理组织学观察为基础,建立检测绵羊肺炎支原体的间接免疫组织化学和间接免疫荧光方法,以绵羊肺炎支原体标准血清为一抗,分别以家兔抗山羊Ig G-HRP和家兔抗山羊Ig G-FITC为二抗,对绵羊肺炎支原体阳性肺组织切片及阴性对照组切片进行HE染色、免疫组织化学染色及间接免疫荧光染色,并优化染色条件,以确保组织切片在最佳的条件下进行鉴定。结果显示,本试验所建立的免疫组织化学方法与PCR方法对病样的检出率相符,且高于传统的分离培养法。结果表明,本试验建立的间接免疫组织化学方法和间接免疫荧光方法可用于对临床病例的组织样本检测,具有很强的特异性和可靠性,可直观地观察和探究该病原在机体内的定位、动态分布以及致病机理,以期为临床诊断提供更可靠的方法。     

牛隐孢子虫病的研究——病原学鉴定

本文对西安地区流行的奶牛腹泻,进行了病原学调查。从死牛和病牛肠内容物分离卵囊,作光镜、电镜及不同染色标本镜检。用牛体分离的虫株接种雏鸡、雏鸽、小鼠、犊牛等实验动物进行生物学传递试验。对自然死亡牛和实验动物进行病理学观察。结果:在病牛粪便中查到大量圆形和椭圆形隐孢子虫,大小为2.5～6.0μm或3.5～6.0×2.5～4.5μm,其感染率:犊牛为75.40％,青年牛为6.25％,成年牛为29.36％;发病率分别为50.80％、0％和27.52％。球虫(E.bovis、E.brasiliensis、E.cylindrica)感染率:犊牛为7.34％、青年牛0％、成年牛2.13％。参与生物学试验的动物均发生感染,雏鸡和犊牛出现明显的临床症状,小鼠和雏鸽呈隐性感染。病理学变化、实验动物与自然病例一致,均以肠道为主,其他脏器无异常。     

牛支原体诱导宿主免疫应答的研究进展

牛支原体(Mycoplasma bovis)是一种重要的兽医病原体,牛支原体感染给当前世界养牛业造成了重大的经济损失。本文从天然免疫、体液免疫和细胞免疫三个方面,对宿主感染牛支原体后的免疫应答特点进行了概括和讨论,可帮助我们更好地了解牛支原体与宿主的相互作用,也为合理地设计和研发有效的牛支原体感染防控技术提供参考。     

牛巴贝斯虫体外培养体系的建立

利用静相培养技术,建立了牛巴贝斯虫(Babesia bovis)的体外连续培养体系,测定了虫体的生长特性和对不同种属动物红细胞的侵染性。结果显示,牛巴贝斯虫的生长周期介于33.66～38.51h之间;在体外可入侵牛、人、驴和绵羊的红细胞,难以侵入山羊的红细胞,且只在牛红细胞中实现传代培养。该方法的建立为寄生虫和宿主细胞相互作用的研究、治疗药物的筛选、诊断和疫苗用抗原的鉴定等提供了技术平台。     

牛和猪人工感染牛带绦虫的囊尾蚴形态与肝组织的病理变化

将试验动物牛和猪分为 4 组:A组(从江牛带绦虫感染牛组)、B组(从江牛带绦虫感染猪组)、C组(都匀亚洲牛带绦虫感染牛组)及 D组(都匀亚洲牛带绦虫感染猪组)。分别灌喂从江牛带绦虫和都匀亚洲牛带绦虫的孕节,并于感染后第67 d剖检,对牛带绦虫人工感染牛、猪的囊尾蚴形态与肝组织的病理变化进行了观察比较。结果显示,A组、B组、C组囊尾蚴分布在肝,C组囊尾蚴分布在肝、心、肾及四肢肌肉等;A组、B组囊尾蚴外有少量纤维组织包绕,A组囊尾蚴囊壁向囊腔内突出生长,周围有少量嗜酸性粒细胞浸润;B组、D组囊尾蚴发生坏死、钙化,周围有大量嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润,D组肉芽肿形成,B组、D组均有大量纤维组织增生。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a( )中,得到重组质粒pET64-85。该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21(DE3)转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2 螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。     

黄牛感染人乙型肝炎病毒的研究

人乙型肝炎是危害人体健康的主要传染病。本试验在黄牛猝死症死亡牛的肝脏中,通过反向血凝试验及电镜观察,有6头牛的肝脏检出人乙型肝炎病毒。并对曾与阳性病死牛同槽饲养牛的20份血清检测,乙肝表面抗原阳性4份,e抗原阳性3份,表面抗原抗体阳性7份,抗e抗体阳性17份,抗核心抗体阳性9份。同槽饲养中感染率为85％。     

三种抗原对家畜日本血吸虫病诊断价值的比较

以日本血吸虫基因重组抗原LHD-Sj23/pGEX、可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)及SEA经Sephadex G-200柱层析分离后得到的第一峰SEA1作为诊断抗原,应用ELISA检测人工感染日本血吸虫绵羊血清及自然感染日本血吸虫水牛血清。结果显示,三种抗原用于检测人工感染日本血吸虫绵羊血清的阳性符合率分别为88.79%、98.15%、100%,阴性符合率均为100%;自然感染日本血吸虫水牛血清的阳性符合率分别为80%、80%、84%,阴性符合率分别为88.9%、93.3%、91.1%;三种抗原与伊氏锥虫病牛血清无交叉反应;检测感染日本血吸虫不同时间绵羊血清,发现感染6周后均被检出针对这三种抗原的特异性抗体,且SEA及SEA1在感染4周后即可检出特异性抗体。三种抗原的诊断效果差异不显著。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

肺泡巨噬细胞在猪链球菌2型引致肺炎过程中的作用

为探明肺巨噬细胞在猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引致肺炎过程中发挥的作用,用SS2体外感染4周龄SPF巴马小型猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),首先以10倍递增的SS2∶PAM感染比(MOI)分别为1∶10～1 000∶1感染12h;其次以MOI=100∶1分别感染1、2、4、6、12、24h,ELISA检测三种主要炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的质量浓度及动态变化,同时光镜观察PAM的形态变化。结果显示,三种细胞因子具有相似的动态表达趋势,其表达量均随MOI升高和作用时间的延长而上升,与对照组之间均差异极显著(P<0.01),菌液浓度之间和时间点之间均差异显著(P<0.05);同时PAM的形态异常和崩解死亡比例依次增多,表明三种炎性因子的表达量与SS2的浓度和感染时间之间呈正相关;受损或濒死细胞比例亦正相关;提示三种炎性因子由受损细胞或濒死细胞产生。MOI为1∶1感染12h,或MOI为100∶1感染6h的条件下均可致70%的PAM崩解死亡,表明此条件下SS2可摧毁由PAM构筑的第一道防线。三种炎性细胞因子表达最高峰的条件是MOI为100∶1,感染12h,此时镜下细胞几乎全部崩解死亡,表明PAM的完全死亡伴随炎性因子的最大释放,炎症随吞噬功能的完全丧失而开始。结果表明,在SS2引致肺炎过程中,AM的作用是炎症的起始者,而不是抵御细胞。