蓝舌病病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的蓝舌病病毒(BTV)11型VP7免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,借助间接ELISA筛选,获得了3株分泌抗BTV11 VP7的群特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为C12D9、B4 F3、E1 A7.这3株杂交瘤细胞株连续传代3个月再经液氮冻存6个月后复苏培养,仍能稳定分泌特异性McAb.3株McAb均具有ELISA特性和免疫沉淀特性,其中C12D9株上清液的ELISA效价为1256,腹水的ELISA效价为10-6.亚类鉴定,C12D9株为小鼠IgG1,B4F3、E1 A7为IgG2a和IgG2b.琼脂免疫扩散试验和间接ELISA试验表明,这3株均与BTV11型VP7发生特异性反应,为BTV群特异性McAb.     

抗鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

以福尔马林灭活的嗜麦芽寡养单胞菌免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌的单克隆抗体(McAb),用软琼脂法进行克隆化培养,通过间接ELISA法对所得的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,并鉴定其Ig亚类,测定腹水效价,进行了相对亲和力和抗原位点等生物学特性分析。结果显示,获得了8株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,分别命名为1C3、1C6、4H8、3D9、2B11、3G3、2H11、1B8。经过鉴定,这8株McAb能够特异性地针对嗜麦芽寡养单胞菌,与其他测试菌之间无交叉反应;其抗体主要分为4个亚类,分别为IgG2a型、IgG2b型、IgG3型和IgM型;腹水效价均在10-6以上;相对亲和力较高;2B11针对的嗜麦芽寡养单胞菌脂多糖表位,而其余7株McAb针对的非脂多糖抗原位点。试验结果证实成功制备了能稳定分泌抗嗜麦芽寡养单胞菌McAb的细胞株,为水产养殖中该菌的快速检测和免疫学研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒整联蛋白受体的研究进展

从组织分布、各毒株利用率、配体结合区介导感染的能力及β亚基胞质区作用等方面论述了4种整联蛋白ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8的研究进展,旨在阐明各整联蛋白决定口蹄疫病毒宿主组织嗜性的作用,并为口蹄疫病毒致病机制的研究提供理论依据。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

乳牛L-选择素单克隆抗体的制备与亚类鉴定

以乳牛L-选择素为免疫抗原免疫BALB/c小鼠1只,相隔14 d进行3次免疫,抗原用量每次30μg,首次免疫后第116 d进行尾静脉加强免疫,抗原用量10μg。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后接种12块96孔板。以L-选择素包被酶标板,间接ELISA检测阳性孔,有限稀释法克隆阳性孔,筛选出6株杂交瘤细胞。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株制备McAb,并对其分别进行Ig亚类测定。结果,6株杂交瘤细胞7B10、10F6、10E2、5C6、12G7和11A3的Ig亚类分别是IgG2a、IgG2aI、gG2bI、gG1I、gG1和IgG1。     

传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备及其抗病毒活性的分析

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒样颗粒重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得7株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。用间接免疫荧光试验和病毒中和试验分别测定McAb的特异性和抗病毒活性,杂交瘤细胞株2C8分泌的McAb具有较高的抗IBDV活性,培养上清液中的抗体中和效价为210,诱生BALB/c小鼠腹水中的抗体中和效价达到107,抗体亚类为IgG1κ。将2C8-McAb制成注射液,经肌肉注射,在12h内,鸡血液循环中的鼠源McAb达到高峰,半衰期至少可持续14d。在IBD预防试验中,注射2C8-McAb的鸡可抵抗IBDV强毒感染。在IBD治疗试验中,对IBDV强毒感染发病鸡用2C8-McAb治疗,存活率为60%(18/30),第21天检测法氏囊组织IBDV全部为阴性;而非治疗对照组,发病鸡的存活率只有20%(6/30),第21天检测存活鸡法氏囊组织IBDV全部呈阳性。本试验结果表明,高中和活性的2C8-McAb对IBD具有良好的预防及治疗效果,能够显著降低死亡率,并且McAb治疗康复鸡不带毒。     

玉米赤霉烯酮免疫检测技术研究——分泌抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用F-2-BSA人工抗原免疫Balb/c鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,建立6株分泌抗F-2毒素的McAb杂交瘤细胞株。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体滴度为2084~×(4H_8)、256~×(6H_9、4H_3、2H_5、2C_8)、16~×(3F_(10));腹水抗体滴度为10~(-9)(4H_3、4H_8),10~(-8)(2H_5)、10~(-7)(6H_9)、10~(-6)(2C_8)、10~(-5)(3F_(10))。用竞争间接ELISA法测定6株McAb对F-2毒素的敏感度为0.8～0.3ng/ml。该抗体与同系物(玉米赤霉烯醇)交叉反应率为9.0％～1.3％。6株McAb均属IgG类。细胞体外传代培养和冻存复苏后,分泌抗体稳定。纯化抗体在37℃保存12天稳定。     

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定.结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2b、IgG2b、IgM和IgM.采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白.     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

抗弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗弓形虫SAG2蛋白的单克隆抗体(McAb),用纯化的rSAG2蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选稳定分泌高效价McAb的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单抗。用ELISA方法测定其效价;单克隆抗体类型鉴定试纸条鉴定其类型;Western-blot和IFA试验进行特异性鉴定。结果显示,筛选出2株能稳定分泌抗SAG2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5E2、2A8。间接ELISA测定其效价分别为1∶256 000、1∶128 000;2株单克隆抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链;Western-blot与IFA试验表明,这2株McAb均能够特异性识别天然构象的SAG2蛋白,并且进一步说明此蛋白是位于弓形虫膜表面的蛋白。成功获得了具有较高特异性及敏感性的抗SAG2蛋白的单克隆抗体,并能特异性识别天然构象的SAG2蛋白,为弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

分泌抗赭曲霉素A单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用赭曲霉素A(OA)-BSA合成抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与sp2/0细胞融合。通过克隆和ELISA法筛选,建立三株分泌抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞株(3C_(12)、1D_(12)和2G_7)。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体效价为128~χ(3C_(12))和64~χ(1D_(12)和2G_7),腹水抗体效价为10~(-7)(3C_(12)、1D_(12))和10~(-6)(2G_7)。三株单抗(McAb)'均属IgG类,分泌抗体稳定。用竞争间接ELISA测定三株McAb对OA的敏感性为22.5～39.2ng/ml,与异种毒素黄曲霉毒素B_1和ZEN毒素无交叉反应。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

抗水貂肠炎病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

将水貂肠炎病毒SMPV-11株纯化后免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,获得了8株稳定分泌抗水貂肠炎病毒SMPV-11株单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、H5、F5、F4、A9、B7、H11和H8.经过鉴定:其腹水ELISA效价分别在1:6.4×103和1:2.56×104之间;且与犬瘟热病毒、阿留申病病毒、犬腺病毒不发生交叉反应;而与水貂肠炎病毒、犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒呈特异性反应;这8株单克隆抗体均为IgG类型.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型(SS2)毒力因子的特异性检测方法,研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行了分析.将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,以纯化的MRP蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP McAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3.经用间接ELISA方法测定,单抗腹水的抗体效价均超过1105,杂交瘤细胞培养上清液的效价为1128～11 024.western-blotting鉴定结果表明,6株单抗均具有特异的生物学活性;以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP.