埃博拉病毒苏丹型核蛋白的原核表达及纯化

将目的基因NP亚克隆入原核表达质粒pET-28(a)中,构建了重组表达载体pET-28(a)-S-NP,然后用重组质粒转化BL21(DE3)感受态细菌,并利用IPTG诱导蛋白表达。将表达的蛋白利用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,重组质粒经双酶切后可得到与目的片段长度相同的特异性条带;测序结果显示此特异性条带与参考序列完全匹配,没有突变。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,表达正确。结果表明,成功构建了重组表达质粒,且表达产物正确。     

马尔他布氏杆菌KdtA基因的克隆及原核表达

为了研究马尔他布氏杆菌KdtA蛋白的功能,根据GenBank中公布的马尔他布氏杆菌M5-90株KdtA基因序列,利用DNAMAN软件设计上、下游引物,以M5-90株的基因组DNA为模板,采用PCR对其进行扩增,凝胶回收纯化后得到1 341bp的目的片段;然后构建克隆重组质粒pMD20-T-KdtA,将其转化到大肠杆菌DH5α;待测序正确后,构建原核表达质粒pET-28a(+)-KdtA,再将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对基因的表达情况进行分析检测。结果表明,成功克隆了KdtA基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了KdtA基因;经诱导后得到了预期的目的蛋白,证明KdtA基因得到了成功表达。     

马尔他布氏杆菌divK基因的克隆与原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌M 5-90株divK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中M5-90株divK基因序列,设计了1对引物;以此菌株的基因组为模板,用设计的引物扩增出了372 bp的基因片段。用凝胶回收纯化目的基因片段,并将其与pMD 20-T载体连接,转化大肠杆菌(E.coli)DH 5α后测序;测序正确后将此基因片段克隆到pET-28a(+),构建重组质粒pET28a(+)-divK;然后,把构建好的重组质粒转化入E.coli BL 21(DE3)。1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,诱导表达的蛋白与目的蛋白的大小一致,说明本研究成功构建了pET28a(+)-divk原核表达载体,并在E.coli BL21中成功表达了divK基因。     

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.     

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究

为对布氏杆菌DnaK基因的原核表达情况及免疫保护性进行分析,根据Gen Bank中公布的羊种布氏杆菌M5-90的DnaK基因序列,设计引物,合成DnaK基因片段,将其连接到p UC57载体测序;将DnaK基因克隆至原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达;用SDS-PAGE凝胶电泳对DnaK融合蛋白进行分析;利用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化;用Western-blot分析其反应原性。将DnaK融合蛋白免疫小鼠,利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。结果显示,获得pET-28a-DnaK重组表达质粒,大约在69.8 ku处出现DnaK融合蛋白条带;纯化后条带单一;DnaK具有较好的反应原性;DnaK融合蛋白可诱导小鼠血清产生抗体IgG和细胞因子IFN-γ。结果表明,DnaK融合蛋白可作为候选亚单位疫苗。     

牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为深入研究牛分枝杆菌PtpA基因在细胞免疫过程中所发挥的具体调控作用,本研究以牛分枝杆菌基因组为模板扩增得到PtpA基因,通过分子克隆的方法构建完成PtpA基因原核表达载体,并将表达载体质粒转入感受态细菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,在约35 ku处可见特异性蛋白条带。以抗组氨酸标签(HIS)单抗为一抗,对表达产物进行Western-blot检测,结果显示,表达产物可与抗HIS标签单克隆抗体发生特异性结合,证明该蛋白为所需的PtpA蛋白。通过免疫新西兰大白兔获得抗PtpA血清,所得血清用间接ELISA方法测得的血清抗体效价超过1∶1 000 000,具有较好的灵敏性。采用制备的PtpA多克隆抗体检测表达纯化的PtpA融合蛋白及真核表达的PtpA蛋白,结果可在约35 ku和约20 ku处产生特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。本研究为后续PtpA基因调控细胞免疫的具体机制的研究奠定了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

比格犬α7干扰素成熟肽基因的原核表达及表达产物活性的分析

从比格犬的脾中提取基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增比格犬α7干扰素成熟肽基因。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体,转化入感受态细胞DH5α中,PCR检测及测序鉴定结果表明,克隆的目的基因为比格犬α7干扰素成熟肽,与GenBank中登录的犬干扰素序列(NM001006654)的同源性达到100%。在此基础上构建重组原核表达质粒pET-32a-CaIFN-α7,并转化至表达宿主BL21(DE3)中。该工程菌在37℃经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约38.4ku处出现了目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经Bandscan软件分析,表达产物约占菌体总蛋白的48.5%。用Protein Refolding Kit对包涵体进行纯化复性,重组CaIFN-α7在犬肾细胞(MDCK)上具有较高的抗病毒活性。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。