从流产羔羊骨髓中分离出一株牛I型布氏菌

为考核我区经多年的布氏羊型5号菌苗气雾免疫后的效果,我们曾在酒泉、金塔、玉门、安西、敦煌等5个县(市)开展布氏菌病检菌工作,共收集牛、羊、猪可检材料1557份,其中:流产胎羔582份,在酒泉、安西检出可疑布氏菌8株。对这些可疑菌株进行了菌型鉴定和毒力测定,其结果报告如下:(一)材料与方法1.布氏菌多价诊断血清:为兰州生物制品所生产,批号:9001,效价1:3200。2.M_(104)冻干菌苗:为兰州生药厂生产。3.S_2冻干菌苗::为兰州生药厂生产。4.M_5冻干菌苗:为兰州生药厂生产。5.单因子诊断血清:ARM,系北京流行病研究所生产。6.牛型噬菌体:由北京流行病研究所生产。     

用绵羊测定副结核病弱毒菌苗免疫效力的研究

80只来自副结核病清净区的羔绵羊,随机地分为试验与对照两组,试验组接种副结核病弱毒菌苗,3个月后试验羊用4株初代分离培养的副结核菌口服攻毒,每周攻毒1次,连续攻毒10次,每次每只羊攻毒活菌6亿。攻毒结束后3、6、9、12个月分期剖杀试验羊,采取小肠、肠系膜淋巴结等病料进行细菌学和病理组织学检查,以判断副结核病弱毒菌苗的免疫效力。攻毒后3～6个月剖杀的试验羊,试验组与对照组的细菌学和病理组织学检查,差异不显著(P>0.05);攻毒后9～12个月剖杀的试验羊,试验组与对照组的细菌学和病理组织学检查,具有明显的差异(P<0.05)。试验结果表明,副结核病弱毒菌苗具有提高机体对副结核病免疫力的作用。     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株体外培养PalA基因表达规律的研究

为了解对机体免疫反应具有副作用的肽聚糖相关脂蛋白在胸膜肺炎放线杆菌(APP)体外培养中的表达规律,建立了一种SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法,对PalA基因在APP血清7型菌株体外培养不同生长阶段的表达情况进行了监测,并对比分析了菌株生长曲线与该基因的表达曲线。结果显示,成功建立了实时荧光定量PCR标准曲线y=-3.578x+48.982(E=90.3%,R~2=0.999),最低检测浓度为1.1×10~2copies/L,并具有较好的特异性与重复性。菌液生长到第6小时(D_(600)=0.834)进入稳定期,活菌含量最高,达2.38×109CFU/m L,此时PalA基因的表达量较低,为0.609 ng/L,约占总反转录cDNA的0.366‰。菌液生长至第8小时(D_(600)=0.835)达到PalA基因表达最高峰,为0.913 ng/L,约占总反转录cDNA的0.564‰。菌液生长到第6小时满足菌液活性大、活菌含量高且PalA蛋白含量低等特点。本试验为临床APP全菌疫苗的生产提供了一定借鉴。     

产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)乳牛乳腺炎大肠杆菌的检测及其基因型分布

为了解采自内蒙古和上海地区的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)乳牛乳腺炎大肠杆菌的流行特点、耐药性和基因型分布,采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2005年推荐的初筛及纸片确认方法对内蒙古地区的58株和上海地区的22株乳牛乳腺炎大肠杆菌进行了ESBLs的检测及耐药性分析,并采用PCR扩增和PCR产物测序方法对产ESBLs菌株进行基因分型。结果显示,内蒙古地区检出6株产ESBLs菌株,阳性率为10.34%,其中,有1株菌携带TEM-1基因,有1株携带CTX-M-14型基因,而有3株同时携带TEM-1型和CTX-M-14型2种基因,只有1株菌未检出上述基因。上海地区未检出产ESBLs菌株。结果表明,产ESBLs菌株多表现为多重耐药,对各种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株。     

大熊猫被毛可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

为了掌握大熊猫体表被毛可培养真菌的分类情况,采用常规分离培养方法从不同月份(3、6、9、12月份)的大熊猫体表被毛中分离到165株真菌。通过形态学鉴定,用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR鉴定,并进行系统发育学分析。结果,利用ITS区序列进行的PCR鉴定可将大多数真菌鉴定到种,部分真菌只能被鉴定到属。本次试验共分离鉴定出165株真菌,其中毛孢子菌属(Trichosporon sp.)是本次试验中的优势种群,其菌株数最多,占29%;指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、蒙氏毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、蜡蚧霉(Lecanicillium lecanii)等是本次试验的优势菌种。9月份样本分离得到的菌株数量最多,为50株,且包含种类最多,具有丰富的微生物多样性。3、6、12月份样本分离得到的菌株数量分别为38、38、39株。本研究结果极大地丰富了对大熊猫被毛可培养真菌种群的认识,将为大熊猫皮肤病的诊治提供参考。     

大肠杆菌多价菌苗的研究

根据我国大肠杆菌常见的血清型44563(O_(8:)K_(87)、K_(88)ac:H_(19))、C83903(O_(141:)K_(89)[B]、K_(88)ab[L])、C83907(O_(149:)K_(91)、K_(88)ac)、44820(O_(101:)K_(99:)H~-)菌株研制成多价灭活口服菌苗和提纯K_(38)粘着素抗原、肠毒素与口服菌苗混合制成的注射菌苗。对母猪行两个途径免疫,其所产仔猪经哺乳后用异种血清型的菌株进行强毒攻击。其结果:第一组(口服-肌肉注射组)新生乳猪发病率为2.5％,保护率为97.5％;第二组(后海穴注射组)发病率为10％,两组均无死亡;未进行免疫的对照组发病率为37％。带有K_(88)粘着素和产毒素能力的异种血清型的C83552菌株进行致病力测定,其结果:口服96～120亿活菌量的新生乳猪发病率为100％,死亡率为100％;口服48亿活菌量的发病率为100％,死亡率为25％。我们选定96亿活菌量作为攻毒的活菌数,进一步扩大试验,以期用于生产。     

应用NaOH制备胸膜肺炎放线杆菌菌影方法的建立

将培养12、24、48和72 h的胸膜肺炎放线杆菌血清1型shope菌株的菌液浓度分别调至1×10~8和1×10~9CFU/m L,测定氢氧化钠(NaOH)对其最小抑菌浓度;将不同培养时间、2种浓度的菌液与对应的最小抑菌浓度NaOH混合,37℃孵育75 min;间隔取样,对细菌形态学、裂解情况进行观察,确定制备菌影的条件。结果显示,NaOH对各培养时长、2种浓度的胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌液均有裂解效果,37℃作用75 min,均未能检测到活菌,裂解率可达到100%。通过扫描电镜观察发现,细菌菌体形态完好、外膜孔道明显。结果表明,用NaOH成功地制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影,这种新型制备菌影的方法安全、高效,为日后该菌菌影疫苗的生产与应用奠定了基础。     

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌(LM)yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素(LLO)抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O_(88)单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌O88 菌株( MG38e) 热灭活抗原免疫BALB/c 雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与SP2/0 细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ELISA 及凝集试验(IHT) 筛选,获得4 株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养液ELISA 和IHT 效价分别为1∶100 ～1∶1000 和3 log2 ～4 log2 ;腹水效价分别为1∶100 ～1∶4000 和4 log2 ～10 log2 。这4 种单克隆抗体( E1 、E2 、E3 、E4) 均能与鉴定的7 株O88菌株发生凝集反应,E4 株还能与O78菌株发生凝集反应。用单克隆抗体对分离的45 株鸡致病性大肠埃希氏菌进行血清型鉴定,结果5 株为O88 ,与用单因子血清鉴定的结果一致。     

嗜水气单胞菌流行菌株的生物学特性

为分析嗜水气单胞菌现今流行菌株与20世纪80年代末分离的国内疫苗生产株J-1在生物学特性上的差异,对2009-2010年分离的5株嗜水气单胞菌进行了溶血性、溶蛋白性、外膜蛋白图谱、ERIC-PCR图谱分析及斑马鱼致病性试验,并与J-1株作对比。结果显示:5株菌均溶血、溶蛋白,且来自发病鱼的4株菌(NJ-35、XX-52、XY-16、CS-43)胞外产物的活性与J-1株相似,但高于来自健康鱼的菌株(JH-17)。斑马鱼致病性试验表明,来自发病鱼的4株菌毒力较强,LD50为1.2×102～6.9×103 CFU/mL,均属强毒株;来自健康鱼的菌株和J-1株毒力较弱,LD50高于1.0×106 CFU/mL。外膜蛋白及ERIC-PCR图谱分析显示,来自发病鱼的4株菌相似,而与来自健康鱼的菌株明显不同;同疫苗菌株J-1相比,4株来自发病鱼菌株的ERIC-PCR图谱与之相似,但外膜蛋白图谱与之有较大差别。说明疫苗菌株J-1在外膜蛋白表达上与现今流行菌株有一定差别。     

猪小肠结肠炎耶氏菌人工感染试验

近年来福建莆田一些地区猪群发生一种腹泻病流行经过现场调查和实验室研究证实,是由小肠结肠炎耶氏菌引起的。为了证实从病猪分离的小肠结肠炎耶氏菌对本动物是造成与自然病猪同样的症状和病理变化,进行了人工感染试验。现将结果报告如下: 材料和方法 (一)实验材料 1.感染菌株:P:株、P_(49)株、剖_6株均从猪分离的,经鉴定为0:3血清群和生物3型。含VW抗原和自凝性,能侵入Hela细胞。饮菌后能致小白鼠腹泻,便中排出大量小肠结肠炎耶氏菌。     

鸡大肠埃希氏菌制苗菌株的生物学特性研究

对制苗用鸡大肠埃希氏茵O1、O2、O78标准株的培养特性、免疫原性、菌株毒力及保存代次进行了研究.结果表明,3株标准菌在麦康凯琼脂、普通肉汤及鸡裂解血液马丁肉汤琼脂上生长良好,培养后的3株茵均符合鸡大肠埃希氏茵生化特性;用固体培养基培养后的茵液制成蜂胶灭活疫苗,免疫30日龄雏鸡,1-2周后产生保护力,3周攻毒时保护率为100%,对同型异株(湖北地方分离株)的攻击保护率在80%以上;3株茵都能使重20 g小白鼠死亡、4日龄雏鸡死亡,剖解死亡雏鸡,均呈典型大肠杆菌病病理变化;连续传5-10代的3株菌,其毒力明显减弱.     

青海高原产纤维素酶菌的选育

从 11株分离自青海省东部森林的产纤维素酶真菌中 ,筛选出产纤维素酶性能优良的0 14 3菌株 ,根据其形态学特征及培养特性 ,鉴定为康氏木霉 (Trichodermakoningii ) ,该菌湿固体发酵物的滤纸酶活力 (FPA)为 15 μmol/min。 0 14 3菌株经亚硝基胍诱变后 ,获得突变株 0 14 3p ,其湿固体发酵物FPA为 2 0 μmol/min ,是原菌株的 1.33倍。该菌无毒副作用 ,可应用于饲料中 ,作为饲料用酶源菌。     

孕母猪初生仔猪口服大肠杆菌K_(88)ITB双价工程疫苗免疫效力对比试验

用K_(88)ITB工程活疫苗(1)给怀孕母猪组于预产期之前3周,每头口服500亿活菌;(2)给初生仔猪组于出生后24小时,每头口服25亿活菌。试验结果:免疫的怀孕母猪组与初生仔猪组的仔猪腹泻发病率分别比对照组的下降了46.5％和40.9％;两免疫组的仔猪死亡率分别下降了29.4％和25.6％。说明K_(88)疫苗给怀孕母猪接种,更实用且免疫效果更佳。     

重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体 pGEX-6P-1,并在大肠埃希氏菌中进行了表达,表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测 rApxⅡA的免疫原性,分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒,所用菌株分别为同型菌株(APP7型L25-4株)和异型菌株(APP1型 4074株)。结果,免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护,且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明,rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性,作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。     

植物源蜡样芽胞杆菌在动物体内的生物效应

对植物源蜡样芽胞杆菌FS株在动物体内的生物效应进行了研究。结果 ,饲喂FS菌液的断奶仔猪粪便中大肠埃希氏菌、肠球菌明显减少 ,而乳酸菌、双歧杆菌增多 ;断奶仔猪饲喂FS菌液 30d ,日增重比对照组增加 33.6 3% ,腹泻发生率比对照组降低 5 7.14 % ;血清总球蛋白提高4 .80 % ,SOD提高 7.70 % ;以FS 0 .2 5亿菌 /mL给小白鼠饮水 4 0d ,脾指数提高 118.98% ;小白鼠安全试验观察 15d ,未出现死亡 ,饲喂断奶仔猪 30d ,未出现不良反应 ,显示FS菌株安全性好。     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

利用aroA基因建立鸡传染性鼻炎PCR诊断方法

利用aroA基因设计了1对引物,分别对10株标准副鸡嗜血杆菌(HPG)菌株、14株分离的HPG菌株进行PCR扩增,结果均得到了与预期大小一致的片段,而对10株非HPG菌株和3株病毒进行扩增则无相应片段产生;该PCR能检测出10个菌细胞.与常规PCR方法相比,aroA-PCR的敏感性更高.     

羊肺炎霉形体病调查

1992年在西北某地区的3个县10个牧场,对2160余只羊进行了羊肺炎霉形体病的调查,血清样品673份,检出阳性101份,阳性率为16％;并从发病地区羊群采集的2例山羊和1份鼻拭子病料中分离到3株霉形体。经系统鉴定和人工感染试验确诊为羊肺炎霉形体(M.ovipneumonia)。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。