南京某集贸市场淡水鱼感染嗜水气单胞菌的鉴定及毒力因子检测

从南京市某集贸市场所售6种淡水鱼体内分离细菌,根据细菌染色、培养特性及16 S rRNA基因扩增等特点进行嗜水气单胞菌的鉴定,对鉴定阳性的菌株测定其溶血、溶蛋白特性,采用PCR技术调查毒力因子的基因分布情况,以斑马鱼作为实验动物研究了不同毒力基因型代表菌株的致病性.试验共分离得到39株嗜水气单胞菌,检出率为65.0%(...     

质粒指纹图谱法对猪大肠杆菌病的分子流行病学研究

对从母猪和发病仔猪肛拭标本中分离的５株普通大肠埃希氏菌和７０株致病性大肠埃希氏菌进行了质粒指纹图谱分析，并对二者的关系进行了比较。结果表明，７０株致病性大肠埃希氏菌共分为３２种质粒谱型，质粒含有４．４×１０２～９．６２×１０４ｂｐ，相同来源的菌株属于同一种质粒谱型，不同来源的菌株属于不同的质粒谱型。从母猪和发病仔猪肛拭标本中分离的大肠埃希氏菌具有不同的质粒图谱和质粒酶切图谱，提示二者之间无同源性。本试验结果亦证明质粒指纹图谱法适用于大肠埃希氏菌菌株的分型鉴定，是一种简单、快速、有效的方法。     

应用质粒图谱分析大肠埃希氏菌毒力差异的研究

对1株无致病性鸡源大肠埃希氏菌(O21)和5株已知毒力强弱的大肠埃希氏菌(O2、O1、X2、148和O78)进行质粒图谱(PP)分析.结果表明这6个菌株属于不同的6种质粒谱型,其毒力的强弱与其所携带质粒的数量和大小有关,但不同毒力株间也有少数几条相同大小的谱带.试验结果表明PP图谱法可作为大肠埃希氏菌分型和鉴别其毒力的间接分子生物学方法.     

团头鲂致病嗜水气单胞菌的分离鉴定与毒力基因的检测及耐药分析

为鉴定长春市某水产养殖基地患病团头鲂(Megalobrama amblycephala)病原菌,本研究从患病鱼中分离出致病菌WC03株,经人工感染试验鉴定该病菌有较强的致病性,能使团头鲂、小鼠及斑马鱼致病死亡,之后对分离菌株WC03进行形态学、理化特性分析,初步判定该菌为嗜水气单胞菌。进一步使用分子生物学方法检测该菌16S r DNA和gyr B、rpo D和cpn60这3种管家基因,同时对该菌的致病性及毒力基因携带情况进行分析。结果显示,16S r DNA及管家基因系统进化分析表明,该菌与嗜水气单胞菌聚类,且同源性在98%以上。该菌含有气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(aha)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(Lip)及密度感应系统调控基因(Luxs)这7种毒力因子。药敏试验结果表明,该菌对呋喃妥因、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢呋辛这4种药物高度敏感。     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

扬子鳄源变形杆菌的致病性测定及毒力因子鉴定

为确定人工养殖条件下越冬期间扬子鳄尿酸盐沉积的发病原因,对2012—2013年分离于发病扬子鳄或卵的18株普通变形杆菌(Proteus vulgaris)进行PCR鉴定、致病力试验、毒力因子检测。结果显示,18株普通变形杆菌中强毒株的小鼠LD50为2.5×106~5.3×106CFU/m L。采用特异性引物进行PCR,检测到18株菌的Fli L、Zap A、Hpm A、Hpm B、Rpo A毒力因子基因。鉴定出3株强毒性扬子鳄源普通变形杆菌,但并未发现毒力因子与菌株的毒力强弱有直接关系。本研究结果可为深入探究变形杆菌引发扬子鳄发生尿酸痛风并造成死亡的原因提供试验依据。     

水貂A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及免疫原性研究

从送检的疑似多杀性巴氏杆菌感染的水貂中分离到1株病原菌,经培养特性、形态观察、生化试验、PCR鉴定等,确定RC1108菌株为血清A型多杀性巴氏杆菌。水貂回归试验表明,该菌株毒力较强,最小致死剂量为2.5×10~8CFU。制备的灭活疫苗在含菌量为1.5×10~9 CFU/m L时,即可在免疫后第21天提供保护。表明,该分离菌株可以作为水貂血清A型多杀性巴氏杆菌疫苗的候选株。     

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×106CFU/m L,最大值为5.7×108CFU/m L;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、 fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、 37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×103～3.9×104CFU/m L,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

草鱼肠炎的病原菌检验与分析

对２个鱼场的５尾病（死）鱼的肠内容物及肝进行细菌学检验,在其中２尾病死鱼及１尾病鱼的肝中发现形态特征一致的细菌,并分离到菌落特征基本一致的细菌;在５尾鱼的肠内容物中均发现并分离到几乎纯一的与肝中相同的细菌。经对２４株纯培养菌理化特性鉴定,初步表明分离菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、温和气单胞菌（Ａ．ｓｏｂｒｉａ）及豚鼠气单胞菌（Ａ．ｃａｖｉａｅ）,其中以嗜水气单胞菌占优势。回归试验表明,分离鉴定的３种气单胞菌均有致病性。     

岩羊病原性大肠埃希氏菌及A型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

从1只突然死亡的1月龄雄性岩羊体内分离到1株病原性大肠埃希氏菌和1株A型产气荚膜梭菌,经毒力试验测得大肠埃希氏菌LD50为4.4×108CFU,A型产气荚膜梭菌LD50为6.1×109CFU,同时进行了药敏试验,为今后预防和诊疗提供理论基础.     

猪链球菌2型假定外膜蛋白Omp40免疫原性的鉴定

为了研究猪链球菌2型假定外膜蛋白Omp40的免疫保护性作用,根据已发表的猪链球菌2型猪源98HAH33株的Omp40蛋白的基因序列,选择免疫原性较好的基因序列设计并合成引物,以HA9801株的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出Omp40蛋白的部分基因定向克隆至表达载体pET-32a(+)中并转化入BL21(DE3)宿主菌。重组菌经IPTG诱导后的SDS-PAGE图谱显示在52.5 ku处出现融合蛋白的条带。Western-blot结果显示,其与猪源ZY05719株康复血清有良好的免疫反应性。动物试验结果证实,经Omp40蛋白免疫小鼠的血清抗体效价在二免后第7天高达1∶50 800,IL-4和IFN-γ mRNA的表达量在二免后第7天均与对照组相比差异显著(P0.05),并对猪链球菌2型强致病性株HA9801感染斑马鱼提供22%的免疫保护率。本研究为今后猪链球菌病亚单位疫苗的研究提供了实验依据。     

竹鼠源绿色气球菌和大肠杆菌的分离鉴定及致病分析

从贵州省某竹鼠养殖场送检的6只患病竹鼠的不同组织病料中分别分离到两种不同的细菌,经细菌形态观察、生化试验鉴定、16S rDNA基因序列分析,确定两株分离菌一株为大肠杆菌,命名为GZ-QDN1;另一菌株为绿色气球菌,命名为GZ-QDN2。药敏试验结果显示,分离菌株GZ-QDN1对头孢曲松、头孢拉啶、复方新诺明等9种药物有较强的敏感性,分离菌株GZ-QDN2对恩诺沙星、多黏菌素B、新霉素等10种药物有较强的敏感性。动物回归试验结果显示,分离菌GZ-QDN1和GZ-QDN2具有较强的致病性,对竹鼠的半数致死量LD50分别为1.45×106CFU/m L和1.75×106CFU/m L。组织病理学观察显示,死亡竹鼠心脏、肾和肺等发生了细胞排列较疏松、出血、粒细胞浸润等病理变化。本研究从竹鼠体内分离到致病性大肠杆菌和绿色气球菌各1株,为该竹鼠养殖场查明了主要病因并为细菌性疫病的防治提供了用药参考。     

牛源大肠杆菌毒力基因的检测及其对小鼠致病性的研究

为了解肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7黑龙江分离株的毒力及其接种小鼠后所引起的病理组织学变化,对该菌株进行了7种毒力基因的检测和毒力试验;在5周龄昆明小鼠饮水中加入萘啶酮酸预处理,腹腔注射大肠杆菌O157∶H7 1.0×1010 CFU,进行临床观察与病理组织学检查。结果显示,该菌株携带stx1、eaeA及hly基因,未检测出stx2、F4、k99、F17基因;小鼠接种该菌株后24h内全部死亡,半数致死量为7.9×107 CFU,最小致死量为5.0×106CFU。该分离株引起肺出血、肾水肿、肠壁变薄等病理变化。研究结果表明,EHEC O157∶H7黑龙江分离株毒力较强,可引发小鼠器官与肠道出现不同程度的病理变化;这一结果有助于了解大肠杆菌O157∶H7的致病机理和临床诊断。     

火鸡大肠埃希氏菌刚果红阳性表型与毒力的相关性研究

以致病性大肠埃希氏菌刚果红阳性表型(CREC)菌株和刚果红阴性表型(non-CREC)菌株实验性感染火鸡,探讨其刚果红阳性表型与毒力的关系.结果表明CREC株可致80%(8/10)火鸡发病,且症状明显、病变典型.non-CREC株可致40%(4/10)火鸡发病,但症状轻微、且缺乏大肠杆菌病的特征性病变.提示大肠埃希氏菌毒力与CREC有一定相关性.     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

大熊猫嗜水气单胞菌和克雷白氏菌的分离鉴定

从腹泻的大熊猫粪便中分离到 2株细菌 ,用BiologMicroStation细菌自动生化鉴定工作系统鉴定为嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)DNA 1群和肺炎克雷白氏菌肺炎亚种 (KlebsiellapneumoniaeSSpneumoniae)。试验表明 ,2菌对小白鼠有极强的致病性 ,对菌必治和百菌除敏感。     

嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,标记抗嗜水气单胞菌单克隆抗体并制备金标垫。将吸收垫、喷涂有抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜、金标垫及样品垫组装成免疫层析试纸条,建立嗜水气单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟检测样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示:试纸条对豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与嗜水气单胞菌有特异性反应,检测灵敏度为1×105CFU/mL,检测时间小于5min。所制备的嗜水气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。     

貂源铜绿假单孢菌的分离鉴定及其致病性研究

为确定山东威海某养殖场发病水貂的病原菌,从发病水貂肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定其为铜绿假单孢菌。致病性试验中,将8.0×1010CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,感染60日龄健康昆明系小鼠,半数致死量和最小致死量分别为1.4×107 CFU/mL和8.0×106 CFU/mL。剖检死亡小鼠可见皮下和肺出血,并能从死亡小鼠的肺中分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢哌酮等较为敏感,而对青霉素、链霉素不敏感。系统发育分析结果表明,该分离菌株与从小麦中分离的铜绿假单孢菌的亲缘关系最近,据此怀疑该发病水貂有可能是食用了污染的饲料引起的。