布鲁氏菌全基因组DNA芯片研制及比较基因组杂交方法的建立

为利用布鲁氏菌强毒株马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)16M和流产布鲁氏菌(B.abortus)9-941全基因组序列,构建布鲁氏菌全基因组DNA芯片,并将其应用于比较基因组学分析,从基因库下载马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941中的3 218个基因设计引物,经过条件优化和重新设计引物等方法进行大规模PCR扩增,成功扩增3 212条基因。产物纯化后点制醛基修饰玻片,每个基因2个点,加上阳性和阴性对照,芯片上合计6 912个探针。囊括了布鲁氏菌3 212条基因和阳性、阴性对照点。采用Cy3/Cy5双色荧光杂交技术,分别以马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941作为参照和待测样本进行荧光双色杂交分析,成功建立了布鲁氏菌比较基因组杂交分析方法。若干质控杂交结果表明,建立的全基因组DNA芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。证明成功建立了基于全基因组DNA芯片的布鲁氏菌比较基因组学技术平台。     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验.结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×10~5 copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性.表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测.     

乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究

在国内首次建立了乳牛原乳中布鲁氏菌外膜蛋白(OMP)25 ku基因套式聚合酶链反应(nested-PCR)检测技术。结果显示,本方法的特异性好,只能扩增布鲁氏菌DNA,而不能扩增同样能引起乳牛流产的鹦鹉热衣原体、弓形虫、胎儿弯杆菌DNA;乳样的检测灵敏度达50 CFU/mL,重复试验35次,可重复性和稳定性均十分理想;对 4 批 331 头凝集试验阳性(24 份)或阴性(307 份)乳牛的乳样用本方法检测,符合率为100%。在48 h内即可获得诊断结果。本方法同样可用于血液或其他流产病料中布鲁氏菌DNA的检测。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。     

日本脑炎病毒基因Ⅰ型与Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立

为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。     

牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白基因的克隆及其表达蛋白的生物学特性

将通过PCR技术扩增的牛型布鲁氏菌铁离子转运蛋白(Brucellaferric uptake,BfuA)基因克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-BfuA,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下表达出大小约为100ku的融合蛋白His-BfuA。Western-blot分析表明,His-BfuA能与布鲁氏菌阳性牛血清发生特异性反应,表明BfuA具有免疫原性。用His-BfuA作为包被抗原,对35份布鲁氏菌阳性牛血清进行ELISA检测,结果所有被检血清均为阳性反应,表明BfuA为潜在的可用于牛型布鲁氏菌诊断的靶蛋白。此外,对BfuA的亚定位结果表明,BfuA为膜蛋白;对His-BfuA的纤连蛋白结合活性及纤连蛋白溶酶原结合活性的试验结果表明,His-BfuA不具有上述2种活性。上述结果为牛型布鲁氏菌病诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

毛皮兽阿留申病毒可视化交叉等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立快速、特异、灵敏的毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法(CPA),以阿留申病毒属内病毒序列为参考,在VP2序列高变区保守区段设计合成4条特异引物。通过优化CPA反应条件,建立了毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性试验以及对临床样品的检测。结果显示,该方法可扩增水貂阿留申病毒(AMDV)和狐貉阿留申病毒(RFAV),对犬科和水貂组织以及常见病毒无特异性反应;对AMDV、RFAV可视化检测下限分别为5.38×10~2copies/μL、5. 93×10~2copies/μL;对83份临床样品的检测结果显示,其中有16份PCR检测为阴性,CPA、qPCR检测为阳性的样品,表明CPA检测方法优于传统PCR。本试验建立了一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒的方法,通过添加荧光染料实现了可视化检测,它更加适合基层兽医站、养殖场进行快速核酸检测。     

布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法的建立及应用

为建立高效、快速和准确检测布鲁氏菌病原的免疫磁珠qPCR方法,本研究根据GenBank已经发表的布鲁氏菌流产株BRS 19 ku外膜蛋白(Omp19)基因组序列来设计qPCR方法所需要的引物和探针,利用免疫磁珠富集浓缩样品中少量的布鲁氏菌病原,建立了布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法。采用qPCR方法对免疫磁珠分离的布鲁氏菌的敏感性、特异性、稳定性及临床应用进行了研究。结果显示,免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌的最低检测限为1×10~3CFU/mL。该方法可以扩增不同种型布鲁氏菌,对其他细菌没有发生交叉反应。该方法的批内和批间的变异系数均低于10%,具有较高稳定性。免疫磁珠qPCR方法与常规qPCR的符合率为94.74%,具有良好的吻合性。上述结果表明,本研究建立的免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为布鲁氏菌病的准确诊断检测和流行病学调查提供技术支撑。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

马鼻肺炎病毒双重PCR分型检测方法的建立

根据GenBank中登录的马鼻肺炎病毒1、4型(EHV1、EHV4)糖蛋白B(gB)基因特异保守序列(登录号分别为AY665713、AF030027.1),各设计1对引物,建立了同时分型检测EHV1、EHV4的双重PCR方法;确定其最佳工作条件,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。结果显示,在EHV1、EHV4中分别扩增出265bp和537bp的特异性目的条带,而马流感病毒cDNA、马动脉炎病毒cDNA、马乙型脑炎病毒cDNA及马传染性贫血弱毒疫苗株cDNA均未扩增出任何条带。EHV1的DNA最低检出限为2.1pg,EHV4的最低检出限为15pg。表明本试验建立的方法具备很高的应用价值。     

BTV-2型3型4型7型12型HPCE检测方法的建立

为了建立同时鉴别检测蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型的快速方法,针对BTV不同血清型的VP2基因保守区,采用Ge XP原理,设计了5对特异性嵌合引物和1对通用引物,优化建立了可单管同步鉴别BTV2型、3型、4型、7型及12型的HPCE方法。该方法仅对BTV 2型、3型、4型、7型、12型的病毒核酸有扩增,对BTV的其他基因型以及小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒均无扩增,特异性好。敏感性试验结果显示:该方法对单一病毒核酸的最低检测量为100～1 000 copies/μL;对五种血清型病毒混合核酸的最低检测量为100 copies/μL。组内重复试验与组间重复试验结果均一致,重复性好。临床样品和模拟样品检测结果显示,本研究建立的HPCE方法与OIE推荐的套式RT-PCR敏感性一致,且该方法可以特异、敏感、快速地鉴别蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型。     

东北黑熊粪肠球菌PCR检测方法的建立及应用

为建立一种基于细菌16S r DNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,通过死亡黑熊脏器中提纯的粪肠球菌测序结果与NCBI中的粪肠球菌16S r DNA序列(登录号:NZ_AJXO01000024.1)的比对,设计了1对特异性PCR引物,并对PCR反应条件、敏感性和特异性进行了测定。结果表明,扩增条带与预期的产物大小一致,经过测序结果分析,证明该条带为目的条带,其他种属的菌株未见条带;并且当引物工作剂量为0.2 L、酶工作剂量为0.15 L就可以扩增出清晰的目的条带,该方法的最小检出量为86 CFU;通过对13头份来自延边熊场的患病(4头)和健康(9头)黑熊粪便检测,患病样本检验结果均为PCR阳性,表明该特异性PCR诊断方法能简易、快捷地检测粪肠球菌,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供理论依据,同时也为黑熊疾病的防治奠定了临床基础。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的羊口疮病毒(ORFV)序列(Gu320351),针对OrfV的B2L基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测OrfV的环介导等温扩增技术(LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,用建立的LAMP方法对OrfV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而绵羊痘病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、丝状支原体山羊亚种、山羊痘病毒及健康山羊皮肤的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对OrfV的最低检出量为5.3fg,比常规PCR方法高1 000倍。表明建立的LAMP方法特异性强,敏感性高。对6份临床样本的检测结果显示,OrfV阳性检出率为83.33%(5/6),与常规PCR的符合率为100%。本试验为羊口疮病例的临床诊断和OrfV的快速检测提供了新的方法。     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。     

小反刍兽疫病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析小反刍兽疫病毒(PPRV)不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计了1对引物,根据肌动蛋白基因序列设计了另1对引物作为内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。以PPRVNigeria75/1株RNA和山羊组织总RNA混合物为模板,在RT-PCR反应体系内同时加入绵羊肌动蛋白基因引物和PPRVN基因引物,结果可扩增出2条目的条带,序列测定结果证实,分别扩增出了目的基因。对RT-PCR反应条件进行了优化,在最佳反应条件下,该RT-PCR最低可检测到12TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染PPRVNigeria75/1株山羊的血液样品进行检测,结果可扩增出目的基因片段。表明建立的RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性和准确性。     

链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的链球菌属保守基因(EF-TU)、猪链球菌种保守基因(GDH)、C群马链球菌兽疫亚种保守基因(M-like)、猪链球菌型特异性基因(SS1型CPS1I、SS2型CPS2J、SS7型CPS7H和SS9型CPS9H)的序列设计合成7对引物,建立了一次性在属、种、型3个水平上检测链球菌猪主要致病种和型(C群马链球菌兽疫亚种和猪链球菌1、2、7、9型)的多重PCR方法。结果显示,该多重PCR在退火温度为61℃时可一次性扩增出7条符合预期大小、序列正确的基因条带;特异性试验和准确性试验结果均符合预期,无非特异性、交叉反应、假阳性、假阴性条带出现;对16株临床分离鉴定链球菌的检测结果与细菌学鉴定及单纯PCR鉴定的符合率均为100%;敏感性为0.08ng/μL;5次重复试验的结果也完全一致。结果表明,建立的多重PCR方法具有高度特异性、准确性、敏感性和稳定性,适用于猪场链球菌病的监控和流行病学快速诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立与应用

本研究为建立一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,根据PRRSV O RF7基因保守区域序列,设计了三对特异性引物。通过Bst D N A聚合酶、引物、Mg2+、d NT Ps和SY BR G reenⅠ及H NB染料浓度等反应条件优化,建立了PRRSV反转录-环介导等温核酸扩增(RT-L AMP)检测方法 ,62℃条件下反应35 min,肉眼可见白色沉淀,1.5%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,SYBR GreenⅠ染料显示呈绿色。该方法的最低检测限(TCID50)为1×100.5/m L,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒等病原均无交叉反应。110份临床样品检测结果显示,PRRSV阳性率60.0%,与RT-PCR检测结果符合率为85.5%。上述结果说明,该方法操作简便,灵敏特异,可用于PRRSV临床样品的快速诊断。     

产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立

为建立产志贺毒素Ⅱ型变异体(Stx2e)大肠杆菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,参照Gen-Bank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因保守区域设计并合成4条引物,分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及模拟样品检测。结果显示,用所建立的LAMP方法对阳性样品扩增所得产物电泳后呈特征性梯状条带,阴性样品的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,敏感性高于PCR方法(3.8×103CFU/管)。LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。该研究为仔猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测提供了新的方法。