鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

hmpA基因对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存影响的研究

为了探究hmpA基因对鸡白痢沙门菌在胞内生存的影响,本研究利用同源重组方法构建了鸡白痢沙门菌449/87的hmpA基因缺失株(449/87△hmpA),同时利用原核表达载体pMMB207构建了基因回复株449/87△hmpA∷hmpA,并对其生长曲线、生化特性以及其感染鸡源巨噬细胞HD11后一氧化氮合酶(NOS)活性、...     

进口鱼粉和肉骨粉病原性沙门菌的分离鉴定及其16S rRNA序列的同源性分析

从进口的 17批饲料用鱼粉、肉骨粉样品中分离得到 4株细菌 ,采用生化和血清学方法鉴定 ,提取其DNA ,用细菌 16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增 ,并对PCR扩增产物测序 ,将测定的 16SrRNA序列在NCBI数据库中进行序列同源性比较 ,确证为沙门菌 ,其中样品 2、8与鼠伤寒沙门菌的序列同源性大于 99% ,样品 10、11与伤寒沙门菌的序列同源性大于 99%。由此可以认定样品 2、8为鼠伤寒沙门菌 ,样品 10、11为伤寒沙门菌     

鸡鲍氏志贺菌与痢疾志贺菌鸡白痢沙门菌及肠致病性大肠杆菌RAPD鉴别方法的建立

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对鸡鲍氏志贺菌、鸡白痢沙门菌、肠致病性大肠杆菌和痢疾志贺菌的基因组DNA进行了研究,在此基础上分析了鸡鲍氏志贺菌与其他6个菌株的亲缘关系.结果显示,有4条随机引物的扩增多态性良好,共扩增出了64个DNA片段,其中4种菌共有的谱带有3条,而显示多态性的片段有61条,占95.3%.引物P2的扩增图谱不能将志贺菌和大肠杆菌鉴别开,但可将这2种菌与沙门菌鉴别出来;引物P6的扩增图谱清晰且3种菌间有明显差异,可用于上述3种细菌的鉴别.不同细菌间的遗传距离为0.128～0.790,根据遗传距离可将鸡鲍氏志贺菌等7个菌株分为3个聚类群,鸡鲍氏志贺菌分离株位于人痢疾志贺菌类群中,可能是人志贺菌的一个新的亚种.     

大肠埃希氏菌和沙门菌氨基糖苷耐药基因PCR检测方法的建立

采用平板稀释法,选用氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素、卡那霉素和新霉素对22 株猪、鸡大肠埃希氏菌和30株猪、鸡沙门菌进行了药敏试验。结果显示,在4种药物中大肠埃希氏菌对卡那霉素的耐药率最高,达81.8%,而沙门菌则对链霉素的耐药率最高,达60%,两类细菌都对新霉素的耐药率最低。设计了5对引物,对耐药基因aph(3′) Ⅱ、aadA1、aadA2、aadB和aac(3) Ⅰa进行了扩增,获得的基因片段与预期的大小一致;序列分析表明,扩增产物与GenBank中的相应序列有很高的同源性(>99.8%)。采用建立的PCR技术,对22株猪、鸡大肠埃希氏菌和30 株猪、鸡沙门菌的耐药基因进行了检测,证实耐药基因普遍存在,在大肠埃希氏菌中aadA1 基因的检出率最高(12/22),在沙门菌中aph(3′) Ⅱ基因的检出率最高(18/30),在所有的菌株中都未能检测出aac(3) Ⅰa基因。     

减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株的构建及其对雏鸡的免疫活性

为构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株Δcrp基因缺失突变株,并初步观察ΔcrpC79-13缺失菌株作为活疫苗对雏鸡的免疫活性,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的ΔcrpC79-13缺失菌株;通过半数致死量测定其毒力;给4日龄雏鸡口服免疫缺失菌株,在不同时间点根据胸腺、法氏囊、脾等免疫器官发育和平均日增重、外周血淋巴细胞转化试验、Griess法NO测定及血清IgG动态观察免疫水平。结果显示ΔcrpC79-13的毒力较C79-13降低约99.6%(LD50>5.0×109CFU);雏鸡接种ΔcrpC79-13(1.0×109 CFU/只)后不影响雏鸡生长,第14～21天体内特异性细胞和体液免疫水平达到最高。表明成功构建了减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株,其毒力显著降低,免疫雏鸡安全,具有良好的免疫活性。     

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。     

猪沙门菌分离株的毒力及耐药特征

为了检测哈尔滨市猪沙门菌分离株的毒力及耐药情况,对采自健康猪群的非重复35株沙门菌进行了血清型鉴定、人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因的检测与转移试验。结果显示,检出的最主要血清型为猪霍乱沙门菌,共25株,占71.4%(25/35),其次为猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。被攻毒小鼠全部死亡,肝、脾、胃出现不同程度的出血性病变。大部分沙门菌株对临床常用的抗菌药物已产生多重耐药,其中对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类抗生素的耐药性较高,而碳青霉烯类抗生素的体外活性较高。结果表明,碳青霉烯类抗生素可作为临床治疗沙门菌病的首选药物之一。     

鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

狂犬病病毒aG株G基因的克隆与生物信息学分析

为了研究狂犬病病毒aG株的进化情况,分析狂犬病病毒的遗传变异和基因功能,采用BHK-21细胞培养繁殖狂犬病病毒aG株,运用RT-PCR扩增G基因,将其与pMD18-T simple vector连接后转化JM109感受态细胞,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,狂犬病病毒G蛋白基因全长1 575bp,包含1个阅读框(ORF),编码524个氨基酸。生物信息学分析表明,G蛋白的分子质量为58 377.22u,理论等电点为7.080,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为42.99,脂肪指数为88.45,总平均亲水性为-0.106,最大疏水性为3.489,最小疏水性为-2.600,信号肽序列为1～19位氨基酸残基,跨膜区结构分析显示该蛋白为跨膜蛋白,预测可能包含有4个N-糖基化作用位点,2处基于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,13处蛋白激酶C磷酸化位点,12处酪蛋白Ⅱ磷酸化位点;1处酪氨酸激酶磷酸化位点;9处N豆蒄酰化位点;1个酰胺化位点。系统进化分析表明,aG株G蛋白与DRV株进化距离最近。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究

以 4株不同血清型的鸭疫里氏杆菌、5株不同血清型的鸭源致病性大肠埃希氏菌和 5株同一血清型的鸭沙门菌为研究对象 ,分别提取基因组DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行了分析。结果 ,从 2 0条随机引物中筛选出了 38条能在这 3种菌中有较好多态性的随机引物 ,8个有效引物共扩增出了 10 2个DNA片段 ,其中 14个菌株共有的谱带仅有 1条 ,显示多态性的片段有 10 1个 ,占 99.0 % ;对RA的 4个菌株扩增出的谱带数为 5 1条 ,共同片段有 12条 ,多态性片段 39条 ,占 76 .5 % ;对沙门菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 6条 ,共同片段为13条 ,多态性片段 33条 ,占 71.7% ;对大肠埃希氏菌的 5个菌株扩增出的条带数为 4 8条 ,共同片段 4条 ,多态性片段 4 4条 ,占 91.7%。在 8条引物中进一步筛选出 1条引物G12 ,其图谱中 5 35bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有 ,330bp的条带为沙门菌所特有 ,12 2 7bp的条带为大肠埃希氏菌所特有 ,表明G12可作为分子标记用来鉴别这 3种细菌。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒 (CSFV)序列设计并合成了 2 6条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT PCR、NestedPCR和Half nestedPCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段 ,分别克隆和测序 ,构建了C株全基因组cDNA文库。采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CS FVC株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT-PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期(1997-1998)猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到pGEMTEasy载体上,经转化、筛选、鉴定后,测出核苷核序列.4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89.2%-99.7%,相应的氨基酸序列同源性为93.8%-99.0%.这4株流行毒株;与C-株(疫苗种毒)E2基因的核苷酸序列同源性为82.2%-84.3%,相应的氨基酸序列同源性为87.9%-90.2%,表明近期猪瘟流行毒株与C-株的gp55蛋白之间存在一定的差异.