PCR-RFLP用于 ABO分型遇到的问题及解决方法

用 PCR-RFLP技术进行 ABO基因分型,是从基因水平进行 ABO血型判定,具有操作简单、结果准确等优点,特别是能够解决 " 非分泌 " 型斑迹的血型鉴定问题,在法医学中具有重要的应用价值。近年来这种技术已广泛地被国内外众多法医界学者采用,取得了较好的效果 [1-3]。我们实验室应用 PCR-RFLP方法 [4 ]在对刑事案件中 100 多份血斑、混合斑生物物证进行 ABO基因型检测的过程中,对绝大多数生物物证的血型都能做出明确的判定。但曾遇到过两份生物物证,一份是手帕上微量的血迹 ,另一份是阴道擦拭棉签,在结果判定上遇到了问题,不能明确判定血型。原因是,人 ABO基因 233～ 433区域扩增产物经电泳分离后产生的本该为 200bp一条区带,而这两份样品 233～ 433区域扩增产物经电泳分离后除产生 200bp区带外,在 178 bp 位置另显现一条清晰的区带,从而干扰了 KpnI酶切结果的判读,导致不能确定两份样品的基因型。为解决这类样品的 ABO基因分型问题,我们取该手帕血 DNA,对 ABO基因的 233～ 433 与 660～ 788两个区域进行序列分析,报告如下。     

ABO血型的基因型与法医学应用

ABO血型系统是1901年由Landsteiner首先发现的第一个人类遗传标记.由于ABO血型抗原不仅存在于组织细胞,也存在于体液中,抗原相对稳定,保存较持久,分型已标准化,群体资料丰富,故在法医学上一直有着重要的地位.传统的ABO分型采用血清学方法,但其抗原属糖蛋白易失活,自然界中广泛存在类似的物质,都会影响检验效果.因DNA特殊结构,使得稳定性比蛋白更高,是携带遗传信息的物质,因此,从DNA水平对ABO基因进行分型更能准确地反映个体的差异,尤其是PCR技术对微量检材的检验,ABO血型系统的分子生物学分型法已越来越多地被应用到法医学上[1].     

ABO基因分型与多重STR联合检测在法医学中的应用

目的建立ABO基因型和Goldeneye16A试剂盒联合检测的方法,并评价其在法医学实践中的应用价值。方法将6种ABO基因型(A/A,A/O,B/B,B/O,A/B,O/O)的序列特异性引物(PCR-SSP)检测方法与Goldeneye16A试剂盒相整合进行同步分型。通过对460份男性个体血痕样本、9947A DNA及90份案件样本进行检测,考察方法的一致性、灵敏度及对法庭科学检材的适用性。结果应用本文方法可同时检出6种ABO基因型和15个常染色体STR基因座及性别决定基因座,检测灵敏度为125pg,其中ABO基因检测灵敏度达63pg。460份男性血痕和90份案件检材证实该联合分型方法用于各类检材结果准确、稳定。结论本文ABO基因分型与多重STR联合检测方法,适用于各类含有核细胞的生物检材,在法庭科学DNA鉴定中有较好的应用前景。     

4种溶液对陈旧斑迹胶体金试剂条ABO检测结果比较

目的比较4种不同溶液用于陈旧斑迹ABO胶体金试剂条分型检验的结果。方法采集已知血型的静脉血127份,唾液73份制备斑迹,放置1~2年;分别用去离子水、PBS、PBS(含2%吐温20)、PBS(含2%吐温20、1%吐温80)4种溶液浸泡,再用ABO胶体金试剂条检测其血型,观察结果的清晰度及准确度。结果用不同溶液浸泡后进行ABO分型检测结果中,去离子水和PBS溶液分型检测线不清晰,难以判型;含吐温的PBS溶液分型检测线比较清晰,所测样本结果均准确,其中同时含吐温20和吐温80的溶液结果更佳。结论根据本文结果,在陈旧斑迹的ABO血型检验中可选择使用含有吐温的PBS溶液作为斑迹浸泡溶液。     

DNA芯片技术检测HLA-DRB1和ABO基因型

用DNA芯片技术检测HLA-DRB1-ABO基因型。根据HLA和ABO不同基因亚型的独特序列设计探针,制成分型芯片;待检测样品经PCR反应标记上荧光之后,与探针在芯片上进行杂交,通过对杂交产生的荧光信号值进行分析,确定样品DRB1位点和ABO位点的基因亚型。将这一方法应用于111份样本的HLA-DRB1-ABO基因分型并将部分样品进行基因测序。检测结果证明本实验研制的HLA-DR-ABO基因分型芯片可准确分辨出DRB1位点30个等位基因、ABO位点6种基因型。该方法分辨率高、特异性强、重复性好、操作简便,对比常规的PCR-SSP方法,HLA-DR-ABO基因芯片方法更为直观,并具有集成化优势,可以在一张芯片上同时检测HLA和ABO位点,并实现一张芯片多人份,不仅适用于法医学亲子鉴定和个体识别,亦可应用于移植配型、HLA相关疾病及人类遗传学研究。     

法医SNP复合检测体系的构建及应用

目的构建48-SNP位点复合检测体系,用于个体识别、性别鉴定、ABO基因分型。方法采集225份无关个体样本(血斑及口腔拭子),18份案例样本(不同组织及体液斑),选择43个常染色体位点、4个ABO基因位点和1个性别鉴定位点,根据单碱基延伸技术通过GenomeLabTMSNPstream基因分型系统进行SNP分型;并检测体系灵敏度、同一个体不同组织同一性及模拟腐败检材。结果 48-SNP体系分型结果与测序结果的一致性为100%,最小DNA检出量为0.25ng,不同组织来源样本检测同一性很好;利用该体系检测225名无关汉族个体,所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡,整个系统的随机匹配概率为9.4×10-18,累积非父排除率(CEP)为0.999 788,累积个体识别率大于0.999 999 999 999 999 99。结论本文48-SNP体系能同时进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定,可以作为现有STR检验体系的补充。     

ABO基因分型的等位基因特异性引物消耗法

目的建立一种新的ABO基因型分型的等位基因特异性引物消耗法(CASPA)。方法根据ABO基因碱基序列中的第261、297、803nt3处多态性位点设计6条特异性引物及1条公用引物,采用CASPA法鉴定146名中国汉族无关个体血液斑样品的ABO基因型。结果146名中国汉族无关个体血液斑样品中检出AAb、AB、AO1、BOv、O1Ov、AA、BB、O1O1、BO1等9种基因型,结果明确,其基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论ABO基因型CASPA分型方法为ABO血型的鉴定提供了一个新的检测方法。     

单管实时PCR快速检验ABO基因型

目的建立快捷特异的ABO基因分型检测方法。方法根据ABO基因结构特点,设计特异性引物和四色双链探针,采用单管实时PCR方法检测ABO基因,结果与传统免疫学方法相对比。结果该方法可检出常见的3个等位基因,区分常见的6种基因型,全部检测过程可在100min内完成。110例中国人的随机个体定型结果与传统免疫学方法一致。结论实时PCR法进行ABO基因分型,简便快捷,灵敏度高,可以有效地为侦查破案服务。     

运用二重PCR和DNA芯片技术检测ABO基因型

目的以玻片为载体,用寡核苷酸探针杂交技术检测ABO基因型。方法根据ABO基因座外显子6和外显子7的3个SNP点的序列分布特征设计4条寡核苷酸探针,制成分型芯片。将待测样品DNA用末端标记了Cy5的引物进行二重PCR扩增,产物与芯片上的探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号确定样品的ABO基因型。结果利用ABO芯片,可对血斑、毛发等微量检材进行ABO基因型检测。对115名汉族无关个体的调查表明,ABO基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡,等位基因杂合度观察值和期望值分别为0.591、0.616,多态信息含量为0.544,二联体和三联体非父排除率分别为0.188、0.334,个体识别能力为0.777。结论通过DNA芯片检测ABO基因型的技术适用于法医学样本,可满足高通量的检测需求。     

ABO基因型检验及其法医学应用研究

目的 采用ＰＣＲ技术对ＡＢＯ血型系统进行基因型检验。方法 选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增,用限制性内切酶ＫｐｎＩ和ＡｌｕＩ分别酶解扩增产物,电泳分离,银染显色法检测ＡＢＯ基因型。结果 对２７０例血斑,２０例混合斑,２０根毛发,１２份唾液斑等不同的生物检材进行了分型,与血清学方法检验结果相符。结论 该方法能够应用于法医学的检验。     

内蒙古鄂温克族人群30个InDel位点遗传多态性

目的研究30个插入/缺失(insertion/deletion,InDel)位点在内蒙古地区鄂温克族人群中的遗传多态性,并评估其在法医学中的应用价值。方法采集87名鄂温克族健康无关个体的外周血样,提取基因组DNA,对样本的30个InDel位点进行复合扩增并分型,运用优化的Power Stats v1.2软件对各位点进行HardyWeinberg平衡检验及遗传学参数的计算,并采用SNPAnalyzer v2.0软件检验各位点间是否存在连锁不平衡。基于30个InDel位点的等位基因频率进行分子方差分析、主成分分析、系统发育树的构建,探讨鄂温克族与其他群体的关系。结果 30个InDel位点经校正检验后符合Hardy-Weinberg平衡定律。经Bonferroni法校正后,两两配对的InDel位点之间处于连锁平衡状态。群体遗传学研究结果表明,鄂温克族与河南汉族和北京汉族的遗传关系较近,与欧洲和墨西哥地区的族群较远。结论 30个InDel位点在内蒙古鄂温克族人群中具有相对较好的遗传多态性,可作为STR检测体系的有益补充。     

浙江省三门县沿海地区人群血液和尿液中33种元素的生物监测(英文)

目的确立华东典型沿海地区浙江省三门县一般人群血液和尿液中33种元素(Ag、Al、As、Au、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Hg、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Rb、Sb、Se、Sr、Th、Ti、Tl、U、V、Zn和Zr)的正常值参考范围。方法采用电感耦合等离子体质谱法检测272例血液样本和300例尿液样本中33种元素。采用SPSS 17.0软件对所得数据进行正态性检验,将所得数据与已有文献报道进行对比。结果建立了三门县一般人群血液和尿液中33种元素的正常值参考范围,其中Co、Cu、Mn和Sr等元素的正常值参考范围与其他报道相似,而As、Cd、Hg和Pb与其他研究报道存在差异,一般为高于其他报道,而血液中的Ba元素在各国文献报道之间差异较大。结论建立了三门县人群血液和尿液中33种元素的正常值参考范围,并成功应用于两例中毒案例的检测。     

直接扩增法用于重大灾难事故中软骨的个体识别

目的探讨直接扩增法对软骨STR检验的有效性,以提高灾难受害者身源鉴定工作效率。方法采用Power Plex~21试剂盒对88份软骨进行直接扩增法检验,同步进行磁珠法比较分型结果。结果 88份软骨检材中,直接扩增法与磁珠法均成功检出84份检材的STR基因型,两者分型结果完全一致。结论Power Plex~21试剂盒直接扩增法可以应用于软骨STR分型检验,且操作简便、快速,在重大灾难事故身源鉴定中具有很好的应用前景。     

血液中乙醇检验全自动体系的建立

目的建立血液中乙醇含量检验的自动化体系。方法采用自动化工作站提取-顶空气相色谱检验。在自动化工作站提取中,对负压采血、顶空瓶密封时间、取样针进行考察优化,并对自动取样和手工取样进行比较。结果乙醇的自动化工作站提取-顶空气相色谱检验的定量分析数据稳定,两份平行样品相对相差小于5%,优于手工提取。乙醇含量在0.1~3.0 mg/m L范围内线性关系良好(r≥0.999),重现性好。结论该方法具有操作简单快捷、实验流程更加规范、实验数据更加准确、消除人工操作误差、重现性好等特点,可广泛应用于血液中乙醇定性定量的检验鉴定。     

眼损伤图形刺激对比度视诱发电位

目的研究眼损伤者对比度视诱发电位的特征。方法选取本中心行法医临床学鉴定的60例眼损伤者,根据最佳矫正视力分为0.2~0.3(A组)、0.3~0.5(B组)、≥0.5(C组)三组。分别观察100%、25%、10%对比度条件下的对比度视诱发电位波的振幅及潜伏期变化特征,并行统计学分析。结果 (1)相同对比度时,P_(100)波振幅随刺激视角的减小而降低;(2)相同刺激视角时,P_(100)波振幅随对比度降低而降低,组间差异有统计学意义(P0.05);(3)100%、25%对比度时,相同刺激视角(100%7′视角除外),A组与B组差异无统计学意义(P0.05);A组与C组、B组与C组随视力提高,P_(100)波振幅增高(P0.05);10%对比度15′刺激视角,P_(100)波振幅随视力提高而增高(P0.05);(4)相同对比度下,相同刺激视角时,P_(100)波潜伏期随视力提高而缩短,但组间差异无统计学意义(P0.05)。相同刺激视角时,随对比度降低,P_(100)波潜伏期延长,但差异无统计学意义(P0.05)。结论对比度视诱发电位有望成为评估对比度视力的方法之一。     

头发中氯硝西泮的分段分析在药物辅助犯罪案件中的作用

目的通过分段分析头发中的氯硝西泮,对药物辅助犯罪案件中受害人的摄药频度及摄药史进行推断。方法采用液氮冷冻研磨技术联合超声浴技术,以液相色谱-串联质谱法,对6名不同案件中受害人的头发分段分析,并测定各头发段中的氯硝西泮及7-氨基氯硝西泮的含量。结果 6名受害人的部分头发段中均检出氯硝西泮及其代谢物7-氨基氯硝西泮,且头发中药物峰值浓度的出现时间与受害人自述摄药时间相一致。结论头发分段分析可提供摄药频度与摄药时间信息,在药物辅助犯罪案件中具有独特的证据价值。     

基于HPLC-TOF-MS代谢组学方法的溴鼠灵毒性作用评价

目的分析溴鼠灵中毒大鼠尿液的代谢特征,揭示溴鼠灵干预对大鼠毒性作用的分子机制。方法通过构建大鼠溴鼠灵中毒模型,采用高效液相色谱-飞行时间质谱(high performance liquid chromatographytime of flight mass spectrometry,HPLC-TOF-MS)获取大鼠尿液代谢轮廓,并用正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)进行多变量统计分析,找出与溴鼠灵毒性作用密切相关的差异代谢物。结果 OPLS-DA得分图显示给药前后不同时间的大鼠尿液样本代谢物轨迹在各时间段内相似度较好,呈现各自聚类现象。比较溴鼠灵给药前后大鼠尿液样本,筛选出22个与溴鼠灵毒性相关的差异代谢物。结论溴鼠灵主要通过干扰大鼠体内的三羧酸循环、糖酵解、鞘脂代谢和色氨酸代谢等代谢通路发挥毒性作用,且溴鼠灵毒性作用具有累积效应。基于尿液HPLC-TOF-MS代谢组学方法可为溴鼠灵毒性作用的分子机制研究提供新思路。     

六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证

目的建立PCR快速扩增程序和体系,并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术,对24个常染色体STR基因座、1个Y-STR基因座和Amelogenin、Y-In Del基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测,同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试,并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.062 5 ng,快速扩增仅耗时65 min就可获得准确分型;种属特异性高;各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率,分型准确、稳定,对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。     

GPD1-L基因检测及其与青壮年猝死综合征的相关性

目的探寻甘油-3-磷酸脱氢酶样基因(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene,GPD1-L)的变异位点,讨论其与青壮年猝死综合征(sudden manhood death syndrome,SMDS)的关系。方法提取SMDS组及健康对照组血样的基因组DNA,采用PCR法扩增GPD1-L基因编码区外显子、外显子-内含子交界区以及3′侧翼区序列,直接进行DNA测序以明确遗传变异类型,并进行基因型频率和等位基因频率的统计学分析。结果在SMDS组中共检测到2个变异位点,c.465CT和c.*18GT,后者在SMDS组和对照组中基因型分布和等位基因频率存在一定差异,但无统计学意义(P0.05)。结论 GPD1-L基因变异与中国人SMDS发生的相关性尚有待进一步研究。     

20723例亲子鉴定中19个STR基因座的突变分析

目的观察并分析肯定亲权关系的案件,探索STR基因座的突变规律。方法采用Goldeneye 20A试剂盒对20723例肯定亲权关系的案件筛选等位基因突变事件,统计各基因座的突变率和突变等位基因的来源、片段大小、突变步数及重复单位的增加或减少情况,分析突变相关因素的特点。结果 19个STR基因座共发现548例突变,观察到557个突变事件,基因座的突变率为0.07‰~2.23‰。父系突变与母系突变的比例为3.06∶1。突变以一步突变为主,增加与减少重复单位的情况相当;二步以上(含二步)突变更易出现重复单位减少。突变主要发生于中等位基因,重复单位增减比例相当,长等位基因突变中重复单位减少显著多于增加。父系突变出现重复单位增加与减少的比例相当,母系突变重复单位减少较增加多见。结论各基因座的突变率差异具有统计学意义,当出现1~2个基因座不符合遗传规律时,应当加测其他检测系统,并结合突变基因座的信息计算PI值,以进一步明确鉴定意见。