AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒快速直接PCR扩增初探

目的 探索可应用于法医实践的快速直接PCR扩增方法,以缩短扩增时间,提高STR分型速率.方法 联合运用AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒与TaKaRa快速PCR检测试剂构建快速直接PCR体系,以FTA血卡为模板,采用优化后的扩增程序在快速PCR仪上进行扩增,分型结果与常规直接扩增方法相比较.结果 AmpF(l)fSTR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒与TaKaRa的快速PCR检测试剂针对血卡的联合扩增,所得STR分型结果与常规方法一致,扩增用时由常规直接扩增所需的175 min缩短为55 min.结论 采用快速直接PCR方法进行扩增,可得到与常规直接扩增一致的DNA分型,扩增时间明显缩短,DNA分型速率大幅提高.     

荧光STR直接复合扩增试剂缓冲体系的研制

目的研制适用于数据库样本荧光STR直接复合扩增体系。方法针对常规血卡、FTA和903血卡样本,配制扩增缓冲液基准母液,采用不同配方的扩增缓冲体系进行直接扩增及检测。考察不同种类增强剂、4种商业化DNA聚合酶、不同复性温度和终延伸时间对检材的检测效果,并验证优化体系的适应性。结果采用本文所建体系对各类血卡样本进行检验,均可获得样本清晰、完整的STR分型。体系选择BSA\Tween20\DMSO\甘油等增强剂组合、Typer热启动聚合酶1.5U/10μL、57～59℃复性温度、30～50min终延伸时间,采用10μL体系即可对直径1.2mm FTA卡血样进行有效分型。结论本文所研制的缓冲体系能够满足常规血卡、FTA和903血卡样本直接扩增检验的需要。     

批量陈旧血样DNA的自动化检验

目的建立批量陈旧血样DNA自动化提取检验的方法。方法采用普通磁珠法和本文建立的磁珠法经TECAN Freedom EVO150—8型自动化工作站分别提取540份陈旧血样模板DNA,采用Sinofiler^TM试剂盒进行荧光标记复合扩增。结果采用普通磁珠法和本文所建DNA提取方法,在540份样本中获得全部基因座STR分型的样本分别为217份和488份,检验成功率分别为40．2％和90．3％。结论本文所建方法可显著提高大批量陈旧血样自动化检验成功率。     

应用DNA工作站进行批量血斑STR分型的研究

目的建立对大批量血斑样品PCR-STR基因分型检测的自动化新方法。方法应用自动化DNA工作站改良优化Chelex-100法和DNAIQ磁珠法的实验条件,建立两种批量血斑的自动化DNA提取方法;筛选确定PCR-STR反应体系的构建和PCR-STR产物测序电泳分析前处理程序。结果1104份血斑样品经Chelex-100法批量提取、Profiler Plus试剂盒扩增均一次检出9个STR基因座,定量PCR测定模板浓度均值为0.43ng/ml,荧光检测信号在200~800RFU之间;对其中114份血斑样品用DNAIQ磁珠法批量提取、同试剂盒扩增均一次检出9个STR基因座,定量PCR测定模板浓度均值为0.7ng/ml,荧光检测信号在1000~2000RFU之间;对其中50份血斑进行自动和手动Chel-ex-100检验法比较,成功率分别为100%和98%,且前者等位基因峰高信号更均衡。结论本文建立的自动化DNA工作站批量检测方法,在成功率、稳定性、均一性等方面具有优势。     

自动化工作站与Chelex-100法对血样本检验效果比较

目的比较自动化工作站与Chelex-100法对不同浓度血液样本的检验效果。方法取新鲜血液,按倍量稀释法制成2~1 024倍10种不同浓度的血样本,分别采用自动化工作站和Chelex-100法提取模板DNA,应用Identifiler Plus试剂盒进行扩增及毛细管电泳检测,并对电泳结果进行比较。结果稀释2~32倍的血样本,采用两种方法的检验成功率均可达到100%;稀释64倍的样本,Chelex-100法成功率为41.3%、完整分型数为78.3%,自动化工作站成功率为13.0%、完整分型数为43.5%,两者比较,差异均有统计学意义(P0.01);稀释128倍的样本,成功率在Chelex-100法(8.7%)和自动化工作站(2.4%)之间比较,其差异无统计学意义(P0.05);稀释256倍以上,两种方法均无法获得分型结果。结论自动化工作站适用于一定浓度血样的检验,而对于微量血样,Chelex-100法的效果可能更优。     

法医物证DNA自动化检验技术体系的研究

目的建立自动化工作站同步提取不同种类涉案法医生物检材DNA的新方法。方法选用TECAN Freedom EVO100．4、75—2型自动化提取、加样工作站,采用磁珠法及Chelex-100法对各类涉案生物检材进行DNA提取、PCR扩增、毛细管电泳检测其STR分型,进行比较测试。在“全国公安机关DNA数据库应用系统”中建立并应用实验室信息管理系统（LIMS）模拟实施规范化DNA检案。结果1552份各类检材,采用工作站-磁珠法提取DNA效果最佳,STR检测成功率为95％,工作站-Chelex法为88％;二者分别与其手工提取法比较,成功率无明显差异。92个样本同期检测,自动化工作站较手工操作DNA检案时间可缩减1．25倍。结论工作站域珠法提取涉案检材DNA,可获得满意的STR分型结果。应用LIMS管控,可有效防控污染,明显提高检案效率及鉴定质量。     

FTA卡血样快速直接PCR扩增方法比较初探

目的探索FTA卡血样快速直接PCR扩增方法,比较相关方法的应用价值。方法将DNA TyperTM19试剂盒分别与3种快速试剂(Roche、TaKaRa、Fermentas)组合,以FTA卡血样为模板构建扩增体系,按照经优化的循环参数进行快速直接扩增,并与Typer19试剂盒常规方法相比较,对方法进行评价。结果 Typer19试剂盒分别与3种快速PCR检验试剂进行组合,均可实现快速直接扩增,STR分型结果均与常规方法一致,扩增用时60min,较常规扩增所需的215min缩短了约70%,但Typer19试剂盒与Roche试剂组合基因座间峰高有部分不平衡;与TaKaRa试剂组合扩增个别基因座出现双肩锋;与Fermentas试剂组合扩增峰高明显不平衡,且个别基因座存在双肩峰。结论应用DNA TyperTM19试剂盒与快速试剂组合直接PCR扩增方法,可有效缩短扩增时间,可根据效果在相关实践中选择使用。     

改良硅珠法提取DNA的灵敏性及稳定性评价初探

目的通过比较对改良硅珠法提取DNA的灵敏性和稳定性进行评价。方法样本模板使用9947A(0.1ng/μL),以30pg为等差,配置10~700pg共24种不同浓度的DNA模板,分别采用常规硅珠法与改良硅珠法提取并纯化模板DNA,在Gene Amp PCR System 9700上进行PCR扩增,ABI 3500XL型荧光分析仪进行电泳检测。结果与9947A标准品阳性对照比较,采用常规硅珠法检验,24份样本均未获得成功分型;采用改良硅珠法检验,当模板量达到550pg时,即可得到所有基因座的成功分型;模板量达到580pg及以上时,16个基因座图谱峰值均可超过200RFU,分型稳定准确。结论改良硅珠法提取DNA易于操作,稳定性较好,灵敏度优于常规硅珠法,可在法医微量物证DNA检验中应用。     

AGCU免提取STR荧光检测试剂盒的验证

目的考察AGCU免提取STR荧光检测试剂盒．对保存在滤纸片或FTA卡上血液样本的直接扩增检测情况。方法使用人GCU免提取STR荧光检测试剂盒,对未经提取的滤纸片血液样本、FTA卡血液样本675份进行直接扩增和18个基因座的DNA分型,并对结果的可靠性进行研究。结果18个基因座检测结果与PP16和ID试剂盒分型结果一致,2000年数据库样本成功率92．3％,2001年数据库样本成功率92．6％,2004以后年数据样本及案件样本、亲子鉴定样本成功率在99％以上。结论AGCU试剂盒可以成功地对滤纸片、FTA卡样本的18个STR基因座进行直接扩增检测,检验结果稳定,分型准确。     

磁珠法自动化纯化现场检材DNA方法研究

目的利用TE-MAGS在TECAN工作站上结合磁珠试剂盒,建立自动化工作站批量纯化现场检材DNA的方法,并探讨其在法医物证检案中的应用。方法灵敏度测试:标准品使用0.1ng/μL 9947A,用200μL TES稀释制备DNA总量0.1ng~1ng共10种的标准样品,采用本文方法提取纯化,使用IdentifilerTM试剂盒扩增,用3130XL型测序仪检测,Gene Mapper ID-X分析,分析STR图谱质量;纯化能力测试:在1ng总量的标准样品中加入腐殖酸、血红素,采用本文方法提取纯化、扩增检测,分析STR图谱质量;实际案件应用对比:收集304份现场检材,分别采用本方法和硅珠法进行提取纯化,经扩增检测,统计对比两种提取纯化方法 STR分型成功率。结果灵敏度测试:0.1ng~0.2ng总量标准样品提取的DNA模板,扩增后可检测到部分基因座STR图谱,0.3ng~1ng总量标准样品提取的DNA模板,扩增后可以得到完整的STR图谱;纯化能力测试:对混合有一定浓度的腐殖酸、血红素的标准样品的提取产物检测图谱未见明显抑制;实际案件应用对比测试:304份现场检材工作站磁珠法检出成功率(50%)高于硅珠法(40.8%)。结论本文所建立的方法缓冲范围较大,回收率高,纯化能力强,提取产物STR分型成功率高,适合现场检材批量化DNA检验。     

DNA数据库建设中批量样品不同DNA提取方法的比较

目的比较和选择自动化工作平台提取DNA的方法,并用于DNA数据库建设。方法用手工Chelex-100法、Biomek3000自动化工作平台结合Chelex-100法及DNA-IQTM磁珠法对实验室收集的建库滤纸血样进行DNA提取,荧光定量技术对上述3种方法提取的模板DNA进行测定;扩增产物用3100基因分析仪检测并用基因分析软件分析。结果手工Chelex-100法、自动化Chelex-100法及DNA-IQTM磁珠法提取的DNA模板浓度分别为0.593ng±0.131ng/μl、0.579ng±0.096ng/μl、0.447ng±0.056ng/μl;成功率分别为100%、98.9%、99.5%。结论本文建立的自动化Chelex-100法可用于大规模DNA数据库建设。     

Chelex-100提取生物检材DNA实时PCR定量研究

目的研究Chelex-100法提取的生物检材DNA用量与复合STR分型成功率的关系。方法113份各种生物检材采用Chelex-100法提取DNA，应用Quantifiler人类DNA定量试剂盒在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行实时PCR定量，同时用Identifiler复合扩增系统在ABI 3100遗传分析仪上对这些DNA样品进行STR分型。结果各种生物检材提取的DNA浓度分别为：37份滤纸、纱布血痕0．042～5．28ng／μl，16份口腔拭子1．15—4．21ng／μl，18份烟头0．016～1．46ng／μl，10份肋软骨0．531—14．40ng／μl，8份肌肉5．75—24．80ng／μl，7份指甲0．788—11．50ng／μl，17份精斑0．79～99．50ng／μl。在建立的8μl扩增体系中，根据上述结果，调整用于复合STR扩增的DNA模板量在0．5—3ng之间，大部分样品可获得完全的STR分型。结论Chelex-100法提取的检材DNA模板用量在0．5—3ng之间可得到有效STR扩增，浓度为0．5ng／μl以上的DNA样品，用小体积模板（1μl）比大体积（3μl）模板扩增效果好。     

酶标2G8单克隆抗体斑点ELISA快速检验人血痕G2m(23)因子

利用自制的抗人 G2m(23)酶标2G8酶标单克隆抗体,首次应用直接斑点 ELISA 方法检测血痕中 G2m(23)因子。该法最小检出量为0.000048μl 血清;整个试验可在15分钟内完成。对常见的13种动物血和8种鱼血无交叉反应;盲测450例干血痕结果全部正确。该方法具有快速、准确、灵敏、简便等特点,有较大的实用价值。     

The application of immunoblotting to the phenotyping of group-specific component

A sensitive immunoblotting method for the routine detection of group-specific component (GC) from fresh serum, and from control and casework bloodstains has been developed. GC phenotypes were separated in a thin layer polyacrylamide gel by isoelectric focusing, transferred to nitrocellulose by a rapid capillary blotting procedure, and detected using a double antibody enzyme immunoassay. This method is capable of phenotyping 8 ng of GC extracted from bloodstains, a four-fold increase in sensitivity when compared to immunofixation and silverstaining. A total of 2424 casework bloodstains have been analysed and GC phenotypes identified in 78% of samples. The method is suitable for use in routine laboratories and is more sensitive than other methods for GC phenotyping of casework bloodstains.     

Evaluation of four deoxyribonucleic acid (DNA) extraction protocols for DNA yield and variation in restriction fragment length polymorphism (RFLP) sizes under varying gel conditions.

This study originated from discussions and recommendations of the Technical Working Group on DNA Analysis Methods (TWGDAM). Four bloodstain deoxyribonucleic acid (DNA) extraction protocols and five semen stain DNA extraction protocols were evaluated. Nine laboratories participated in the extraction of DNA from 20 bloodstains and 20 semen stains using each protocol. All blood and semen stains originated from a single donor and were prepared under uniform conditions to permit the direct comparison of DNA yields and restriction fragment lengths. The extracted DNA from approximately 600 bloodstains and 700 semen stains was quantified by yield gel analysis and a slot blot hybridization technique. The extracted DNA was digested and restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns were generated using three single-locus probes. The RFLP sizing data produced from the blood and semen stains were evaluated with respect to (1) DNA extraction method, (2) gel length, (3) agarose type, (4) presence or absence of ethidium bromide in the gel, and (5) fragment sizes obtained from DNA isolated directly from the donor's liquid blood. This study demonstrates conclusively that high-molecular-weight DNA can be isolated using either organic or nonorganic DNA extraction protocols and that the resulting RFLP sizes are highly reproducible regardless of gel length, agarose type, or presence/absence of ethidium bromide.     

Chelex-100法提取滤纸血痕DNA影响因素的比较

目的改进滤纸血痕DNA提取方法,建立更简便、廉价,适合当前DNA建库需要的提取方法。方法将752份滤纸血痕分成四组,分别按照四种不同的Chelex-100法进行DNA提取并进行比较研究;63份新鲜血痕分别按照两种方法提取并进行对比研究。结果对于陈旧滤纸血痕,四种提取方法的检测成功率无显著差异(P>0.05);对于新鲜血痕,两种提取方法的检测成功率有显著差异(P<0.05)。结论对于建库陈旧滤纸血痕样本的DNA提取可采用不加纯水处理,直接加入Chelex-100的方法进行。     

吸附性载体上微量血痕的DNA分型

目的研究吸附性载体上微量血痕的DNA提取及其检验。方法用Chelex-100法、QIAamp MiniKit、及QIAamp Mini Kit改良法提取吸附性载体上微量血痕中的DNA,进行PCR扩增及STR检验。结果采用Chelex-100法及QIAamp Mini Kit的分型成功率很低;采用QIAamp Mini Kit的改良法能较好的得到分型图谱。结论采用QIAamp Mini Kit的改良法能较好的提取吸附性载体上微量血痕的模板DNA。