六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证

目的建立PCR快速扩增程序和体系,并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术,对24个常染色体STR基因座、1个Y-STR基因座和Amelogenin、Y-In Del基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测,同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试,并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.062 5 ng,快速扩增仅耗时65 min就可获得准确分型;种属特异性高;各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率,分型准确、稳定,对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20+4Y-STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI 3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0.05~1.00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0.999 999 999,三联体累计非父排除率达0.999 999 985,Y-STR单倍型多态性为0.592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

24个X-STR及7个Y-STR基因座复合扩增体系建立及法庭科学有效性验证

目的建立24个X-STR基因座及7个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行24个X-STR基因座的遗传多态性调查,并评价该体系的法医学应用价值。方法采用六色荧光标记技术,对24个X-STR基因座(DXS6803,DXS10159,DXS10146,DXS7132,DXS10075,DXS8378,DXS7424,DXS101,DXS6795,HUMARA,DXS10074,DXS6801,DXS6789,DXS10135,GATA144D04,DXS7423,DXS10101,HPRTB,DXS10148,GATA165B12,DXS10103,DXS8377,DXS6797,DXS6810)进行复合扩增和毛细管电泳检测;调查山东汉族1057名无关男性个体24个X-STR基因座的遗传多态性,并对系统性能进行评价。结果本文建立的复合扩增体系中的24个X-STR基因座,在1057名个体中共检出1057种单倍型。方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.0625ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论该复合扩增检测体系可以用于实际案例检验,弥补商品化X-STR基因座复合扩增检测体系的不足,联合应用加入的Y-STR基因座适用于混合斑的鉴别。     

29个Y-STR基因座复合扩增体系的建立CSCD

目的建立29个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行遗传多态性调查,并评价其法医学应用价值。方法采用五色荧光标记技术,对29个Y-STR基因座（DYS456、DYS389Ⅰ、DYS437、DYS447、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS522、DYS460、DYS458、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b、DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570和DYS627）进行复合扩增和毛细管电泳检测。调查山东汉族2 000名无关男性个体29个Y-STR基因座的遗传多态性数据,并对系统性能进行检测。结果本方法同时检测29个Y-STR基因座,在2 000名个体中共检出1 981种单倍型,基因多样性在0.370 0～0.965 4。方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.05 ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论 29个Y-STR基因座复合扩增检测法可以用于实际案例检验,调查所获数据对建立Y-STR数据库的相关研究和应用具有重要意义。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20＋4Y—STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID3．2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0．05～1．00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0．999999999,三联体累计非父排除率达0．999999985,Y—STR单倍型多态性为0．592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

9个Y-STR基因座荧光复合扩增系统的法医学应用

目的建立9个Y-STR基因座的复合扩增系统,提高Y-STR的法医学检测效能。方法6-FAM标记DYS434、Y-GATA-A10、DYS438、DYS439,HEX标记DYS531、DYS557、DYS448,TAMRA标记DYS456、DYS444引物,PCR复合扩增,毛细管电泳得到结果,考察扩增系统的个体识别能力、灵敏度、特异性、组织同一性。结果所建立的9个Y-STR复合扩增系统分型清晰,单倍型多样性达0.9968,特异性好,灵敏度高(0.5ngDNA),并且在男女混合斑检验上较常染色体STR分型更有优势。结论9个Y-STR复合扩增系统具有较高的识别能力,对建立Y染色体STR数据库,研究群体遗传学和进行法医学混合斑物证鉴定有重要意义。     

复合扩增20个Y-STR基因座及其法医学的应用

目的建立20个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行遗传多态性调查,并评价其法医学应用价值。方法采用五色荧光素标记技术,对20个Y-STR基因座(DYS391、DYS389Ⅰ、DYS390、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS460、Y GATA H4、DYS456、DYS439、DYS635、DYS448、DYS393、DYS388、DYS437、DYS19、DYS392、DYS458、DYS447、DYS385 a/b)进行复合扩增和毛细管电泳检测;调查辽宁汉族376名无关男性个体20个Y-STR基因座的遗传多态性数据;并对系统性能进行检测。结果本文方法同时检测20个Y-STR基因座,在376名个体中共检出376种单倍型,基因多样性在0.371 1～0.969 8之间;方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.062 5ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论20个Y-STR基因座复合扩增检测法可以用于实际案例检验,调查所获数据对建立Y-STR数据库和相关研究和应用具有重要意义。     

39个Y-STR基因座复合扩增体系的建立及其在法医学上的应用

目的建立39个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行遗传多态性调查,并评价其法医学应用价值。方法采用六色荧光标记技术,对39个Y-STR基因座(DYS426,DYS593,DYS630,YPENTA1,DYS722,DYS617,YPENTA2,DYS443,Y-GATA-A10,DYS561,DYF404S1,DYS464,DYS713,DYS446,DYS607,DYS708,DYS622,DYS707,DYS520,DYS434,DYS505,DYS709,DYS552,DYS510,DYS508,DYS531,DYS459,DYS587,DYF411S1,DYS594和DYF399S1)进行复合扩增和毛细管电泳检测;调查山东汉族1031名无关男性个体39个Y-STR基因座的遗传多态性,并对系统性能进行评价。结果本文建立的39个Y-STR基因座复合扩增体系,在1031名个体中共检出1030种单倍型;39个Y-STR基因座基因多样性在0.0982～0.9951之间;方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.0625ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论 39个Y-STR基因座复合扩增检测体系可以用于实际案例检验,弥补现有Y-STR基因座复合扩增检测体系的不足,并可细分家系,调查所获数据对建立Y-STR数据库等相关研究具有重要意义。     

29个Y-STR基因座复合扩增体系的建立

目的建立29个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行遗传多态性调查,并评价其法医学应用价值。方法采用五色荧光标记技术,对29个Y-STR基因座(DYS456、DYS389Ⅰ、DYS437、DYS447、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS522、DYS460、DYS458、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b、DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570和DYS627)进行复合扩增和毛细管电泳检测。调查山东汉族2 000名无关男性个体29个Y-STR基因座的遗传多态性数据,并对系统性能进行检测。结果本方法同时检测29个Y-STR基因座,在2 000名个体中共检出1 981种单倍型,基因多样性在0.370 0~0.965 4。方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.05 ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论 29个Y-STR基因座复合扩增检测法可以用于实际案例检验,调查所获数据对建立Y-STR数据库的相关研究和应用具有重要意义。     

24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系的建立

目的构建包含24个Y-STR基因座的荧光标记复合扩增体系。方法选择DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS444 24个Y-STR基因座,构建荧光复合扩增体系。检测该体系的特异性、同一性、灵敏度、扩增均衡性、抗干扰性和准确性,调查其在广东地区人群的基因多样性。结果建立的复合扩增体系在检测的非人类及女性样本中未发现谱带,同一个体不同组织检测结果一致,0.1 ng以上标准品9948可检测获得完整分型结果。常见抑制物中体系内加入120~200μmol/L血红素、1.5~2.0 mmol/L钙离子时出现等位基因丢失,对靛蓝、腐殖酸、EDTA具有较强抗干扰性。通过146例无关个体与Yfiler系统平行检测比对,24 Y-STR检测体系分型准确。广东地区人群单倍型多样性(HD)为0.999 72,优于Yfiler系统(HD=0.998 58)。结论本研究建立的24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系法医学应用前景广阔,可用于案件检验、亲权鉴定与Y-STR数据库建设。     

10个STR基因座荧光复合扩增体系的研制

目的建立10个STR基因座荧光标记复合扩增体系,并评价其法医学应用价值。方法在北京、山西、广东汉族,辽宁满族、西藏藏族群体中调查STR基因座遗传多态性,筛选出9个具有高度多态性和法医应用价值的STR基因座及性别基因座。构建四色荧光素标记复合扩增体系,制备等位基因分型标准物,编制分析软件,并对体系的种属特异性、灵敏度、稳定性、混合样本等检测能力进行考察。结果建立的复合扩增体系遗传稳定好,累积非父排除率可达0.999 96,累积个体识别率可达0.999 999 999 999 3;与CODIS系统均不存在连锁遗传;各基因座间布局合理、无杂峰、扩增结果清晰易辨,并可实现检测分析自动化。体系种属特异性较好,灵敏度为0.1ng,稳定性好,混合样本检出范围在2∶8～8∶2之间。实际案例检材检测结果好。结论本文建立的复合扩增体系在法医学实践中有较好的应用价值。     

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。     

DNATyper~(TM) Y29试剂盒的性能确证

目的评价DNATyper~(TM)Y29试剂盒法医学应用价值。方法该试剂盒是五色荧光标记,包含29个Y-STR基因座,可以用于5色电泳测序仪,适用于Y-STR案件检验和数据库建设工作。该试剂盒包含AmpFlSTR~?Yfiler~?ki的17个Y-STR基因座以及另外的12个Y-STR基因座。本文通过不同反应体积、退火温度和循环次数对该体系进行方法验证,并且从灵敏度、准确性、种属特异性、混合样本、男性特异性、批次间试剂稳定性、不同检材的适应性与一致性等方面对其进行测试。结果该试剂盒分型结果准确、灵敏度高(最低检测模板可达62.5 pg);在1600:1的高浓度女性背景条件下,仍可以获得男性完整分型,具有良好的男性特异性;男性混合样本中,1:3-3:1的混合范围内,可以获得完整分型;此外,试剂盒还具有良好的种属特异性测试、一致性和稳定性。结论上述结果表明该试剂盒可用于法庭科学实际案件检验与Y-STR DNA数据库建设。     

荧光标记8个 miniSTR 及 Amelogenin 复合扩增体系的建立

目的建立非CODIS系统miniSTR以及Amelogenin基因座的荧光复合扩增体系。方法筛选8个多态性高的非CODIS系统miniSTR基因座（D20S1082、D6s474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3$4529、D2S441）,并结合Amelogenin基因座设计荧光标记引物,优化反应条件,建立复合扩增体系。应用该体系对204份广州地区汉族血样,30个家系样本,及30份降解检材进行检测。结果建立的荧光标记8个miniSTR及Amelogenin复合扩增体系分型结果明确,稳定性好,且所有片段长度均少于200bp,提高了降解检材的分型成功率。在广州汉族人群的累积个人识别率为0．99999993,累积非父排除率为0．992287。结论构建的miniSTR荧光复合扩增体系,操作简便,分型准确,重复性好,对降解检材有效,易于在法医实验室推广应用,可对现有试剂盒起补充作用。     

荧光复合扩增4个Y染色体STR的单倍型及其法医学应用

目的建立一套Y染色体STR的双色荧光复合扩增系统,调查4个Y-STR基因座单倍型分布情况及其在混合斑物证检验中的法医学应用前景。方法荧光标记引物复合扩增Y-GATA-A10、DYS531、DYS557和DYS448四个Y染色体特异性STR基因座,并用ABⅠ310遗传分析仪对扩增产物进行检测、分型。结果在成都汉族120名无关男性个体中,四个基因座分别检出5、5、8、7个等位基因,共检出78种单倍型,单倍型基因多样性为0.9881。对3例本教研室不能用常规常染色体STR对男性成份作出同一认定的混合斑检材,该系统成功的作出了与嫌疑人血液Y-STR基因型一致的鉴定结论。结论建立的Y-STR荧光标记复合扩增系统具有很高的识别能力,对建立Y染色体STR数据库,研究群体遗传学和进行法医学混合斑物证鉴定有重要意义。     

Y-STR四色荧光复合扩增系统的建立及其应用

目的建立Y染色体STR的四色荧光复合扩增系统,调查7个Y-STR基因座单倍型分布情况。方法设计3套公共引物对分别嵌合在3组Y-STR基因座的原始引物上(1)YS434、Y-GATA-A10、DYS531、DYS557、 DYS448、DYS456、DYS444),再利用加不同荧光颜色标记的3组公共引物对同时复合扩增,用AB I 310遗传分析仪对扩增后产物进行检测,CeneScan、Genotyper软件进行基因分型。结果 3组复合扩增均可成功进行分型,在成都汉族 120名无关男性个体中,7个基因座分别检出4、5、5、8、8、6、7个等位基因,共检出101种单倍型,其中89种为唯一的, 单倍型基因多样性为0．9958。对1例混合斑物证检材,成功检出了与嫌疑人血样Y-STR基因型一致的结果。结论 Y-STR四色荧光标记复合扩增系统分型可靠,对建立Y染色体STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。     

9色荧光STR复合扩增体系的构建及验证

构建一套包含39个常染色体基因座及Amelogenin性别基因的9色荧光STR复合扩增体系，并验证其在微量与降解检材中的应用效果。根据中国人群核心基因座推荐标准及实际办案需要，筛选出合适的候选基因座，设计引物并以9种荧光染料对其进行标记，构建复合扩增体系并优化；对该体系进行灵敏度、种属特异性、稳定性等确证实验，并通过检验案件样本做进一步评估。结果表明：一套包含39个常染色体STR基因座及Amelogenin性别基因座（其中28个基因座<300 bp）的9色荧光复合扩增体系构建成功。各基因座均衡性良好，灵敏度达0.125 ng，对常见PCR抑制剂具备一定的耐受能力。两性混合样本最低检测比例为1∶4；适用于不同类型案件样本检测，且与市场上其他同类试剂盒比对分型结果一致，种属特异性较好。所构建体系首次采用9色荧光标记技术制成复合扩增试剂，一次性检出基因座数量多，系统效能高；该体系构成以miniSTR为主，对于微量降解检材具有较高的实际应用价值。     

复合扩增A10、C4基因座遗传多态性及法医学意义

目的　建立复合扩增A10、C4基因座的体系 ,研究其在法医学检验中的应用价值。方法　生物学样本用Chelex - 10 0的方法提取DNA ,荧光标记的特异性引物复合扩增A10、C4基因座 ,用ABI 310 0遗传分析仪对扩增产物进行检测分型。结果　A10、C4基因座各检出 6个等位基因 ,GD值分别为 0 .6 86 ,0 .84 6 .共检出 2 3种单倍型 ,其单倍型的个体识别率为 0 .9184。扩增女性DNA ,均无特异性扩增产物 ;调查 30个二代家系 ,均未观察到突变基因的存在。结论　A10、C4复合扩增体系多态性较高 ,对法医学中男女混合检材的个人识别及父系亲缘关系鉴定有较高的应用价值。     

Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学验证

目的：对Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学参数进行验证和分析。方法根据DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM）对试剂盒的法医学验证要求,从PCR扩增体系的测试、重复性、准确性、灵敏度等多个角度对该试剂盒进行检测评估。应用该试剂盒对华东地区517名汉族健康无关个体进行Y-STR基因座分型检测,检测单倍型分布状况及频率信息,并评估该试剂盒的法医学参数。结果该试剂盒对6.25μL扩增体系、DNA量低至125 pg时仍然可以得到准确的分型结果。特异性检测发现该试剂盒对常见的动物DNA和微生物DNA无有效的扩增结果。男性混合样本（1∶19和19∶1）中,较少样本的等位基因检出率可以达到70%以上;在男女混合样本中,女性DNA背景的存在不影响试剂盒的灵敏度。结论 Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒灵敏度高、特异性好,且可以应用于混合物的检测。试剂盒所包含的26个Y-STR基因座多态性良好,可满足法医学实际应用。     

3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系的构建及应用

目的建立D3S3053、D6S474、D20S482（扩增片段〈150bp）3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系,用于高度降解DNA样本的基因分型。方法采用6-FAM、HEX、TAMRA荧光染料标记D20S482、D3S3053、D6S474基因座上游引物,构建并优化复合扩增体系,在ABI310遗传分析仪上对扩增产物进行电泳分析,Genemapper3．2软件分析产物片段大小并进行分型。采用上述体系对120份河北汉族健康无关个体血样进行检测,并计算群体遗传学参数。比较该体系与ID试剂盒用于高度降解检材的成功率及灵敏度。结果D3S3053、D6S474、D20S4823个miniSTR基因座荧光标记复合扩增分型体系稳定可靠,灵敏度达50pg,用于高度降解检材分析的成功率明显高于ID试剂盒。3个基因座在河北汉族人群中的累积个人识别能力为0．998,累积非父排除率为0．84。结论该系统可用于分析高度降解DNA样本的基因分型,进行法医学个人识别和亲权鉴定。