六色荧光标记快速PCR扩增体系的建立及验证

目的建立PCR快速扩增程序和体系,并对其技术指标进行验证。方法采用六色荧光标记技术,对24个常染色体STR基因座、1个Y-STR基因座和Amelogenin、Y-In Del基因座进行复合扩增及毛细管电泳检测,同时考察体系的灵敏度、特异性、同一性、稳定性、混合样本及批量样本测试,并观察各种常见检材及降解、脱落细胞检材的分型情况。结果所建立的体系灵敏度达0.062 5 ng,快速扩增仅耗时65 min就可获得准确分型;种属特异性高;各种纸质血样本和混合、降解、脱落细胞检材的分型正确。结论本研究建立的快速扩增体系可显著提升检验速率,分型准确、稳定,对建立STR数据库、研究群体遗传学和进行法医学鉴定有重要意义。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20＋4Y—STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID3．2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0．05～1．00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0．999999999,三联体累计非父排除率达0．999999985,Y—STR单倍型多态性为0．592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20+4Y-STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI 3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0.05~1.00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0.999 999 999,三联体累计非父排除率达0.999 999 985,Y-STR单倍型多态性为0.592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

15个常染色体和18个Y染色体STR基因座复合扩增检测体系及法医学应用

目的建立15个常染色体和18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的六色荧光标记复合PCR直扩检测体系,并评估其法医学应用价值。方法采用六色荧光标记技术,建立15个常染色体STR基因座(D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、v WA、D21S11、D18S51、D8S1179、D5S818、FGA)和18个Y染色体STR基因座(DYS527a/b、DYS448、DYS456、DYS385a/b、DYS458、DYS391、DYS390、DYS19、DYS438、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA、DYS635)以及Amelogenin的复合扩增体系,收集800份无关人员血样进行基因座检测,评估所建复合扩增体系的稳定性、灵敏度、种属特异性、直扩可行性以及抗抑制性。结果本检测体系对800份无关人员血样复合扩增后,结果准确,灵敏度达0.125ng;种属特异性高;38份案件检材全部准确分型。在对照男性与女性的DNA浓度比值大于等于1:4时,男性DNA的所有基因座均能准确分型。若模板DNA中含一定浓度的已知抑制剂时,所有基因座也均准确分型。结论本文建立的复合扩增检测体系可同时检测15个常染色体和18个Y染色体基因座以及性别基因座,结果稳定准确,灵敏度高,可为法医DNA检测分析提供一个新选择。     

10个STR基因座荧光复合扩增体系的研制

目的建立10个STR基因座荧光标记复合扩增体系,并评价其法医学应用价值。方法在北京、山西、广东汉族,辽宁满族、西藏藏族群体中调查STR基因座遗传多态性,筛选出9个具有高度多态性和法医应用价值的STR基因座及性别基因座。构建四色荧光素标记复合扩增体系,制备等位基因分型标准物,编制分析软件,并对体系的种属特异性、灵敏度、稳定性、混合样本等检测能力进行考察。结果建立的复合扩增体系遗传稳定好,累积非父排除率可达0.999 96,累积个体识别率可达0.999 999 999 999 3;与CODIS系统均不存在连锁遗传;各基因座间布局合理、无杂峰、扩增结果清晰易辨,并可实现检测分析自动化。体系种属特异性较好,灵敏度为0.1ng,稳定性好,混合样本检出范围在2∶8～8∶2之间。实际案例检材检测结果好。结论本文建立的复合扩增体系在法医学实践中有较好的应用价值。     

15个基因座复合扩增体系的建立及新疆维吾尔族遗传多态性

目的建立15个基因座五色荧光复合扩增体系,并调查新疆维吾尔族的遗传多态性。方法筛选STR基因座,等位基因测序后按照重复序列重复次数命名,对建立的15个基因座五色荧光复合扩增体系进行灵敏度、种属特异性、同一性及稳定性检测,对新疆维吾尔族群体进行遗传多态性分析,与西藏藏族、岫岩满族、广州汉族进行群体间比较。结果建立了15个基因座复合扩增体系,检测灵敏度为0.3 ng,具有良好的种属特异性、同一性和稳定性。新疆维吾尔族13个常染色体STR基因座的基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡,无连锁不平衡现象,大部分基因座在群体间差异具有统计学意义。结论建立的体系具有法医物证学应用价值,13个常染色体STR基因座在新疆维吾尔族群体多态性高,适合于亲子鉴定及个人识别,可作为现有基因座的补充。     

五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用

目的建立20个基因座五色荧光标记复合扩增检测体系,并评价其法医学应用价值。方法收集368份无关人血样及55份实际案例样本(包括血斑、体液斑、组织及毛发),采用五色荧光素标记技术,对Amelogenin和19个STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)进行基因型检测,并考察方法的一致性、灵敏度、种属特异性及检材适用性。结果本文五色荧光标记复合扩增检测体系可对所选20个基因座分型,结果稳定准确,且均衡性良好、无杂峰;群体调查显示累积个人识别率和累积非父排除率分别是0.999 999 999 999 999 999 999和0.999 999 99;灵敏度达125pg,种属特异性高,实际案例检材分型成功率高。结论本文五色荧光标记复合扩增检测体系各项指标可达到当前商品化试剂盒的检测水平,具有重要的法医学应用价值。     

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。     

15个常染色体和10个Y-STR基因座复合扩增试剂盒的研发

目的建立法医物证学常染色体和Y染色体综合检测的方法。方法选择常用的常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座,设计复合扩增引物,形成五色荧光标记复合扩增试剂盒。结果开发出一个五色荧光标记复合扩增试剂盒,可同时对15个常染色体STR基因座、1个性别基因座和10个Y染色体STR基因座进行分型检测。结论 15个常染色体STR加10个Y染色体STR检测试剂盒结合毛细管电泳凝胶进行STR分型,结果准确可靠,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

24个基因座复合扩增系统的应用

目的建立24个基因座的复合扩增系统,并对其性能指标进行评价。方法选择24个基因座（包含D8S1179、D5S818、D2S1338、D18S51、D6S1043、D2S441、D3S1358、vWA、D19S433、D16S539、CSF1PO、Penta D、D22S1045、D13S317、D1S1656、D7S820、TPOX、Penta E、D10S1248、TH01、D12S391、D21S11、FGA等23个STR基因座及1个Amelogenin基因座）;合成引物,上游端标记荧光染料;收集DNA数据库建库血痕及口腔拭子样本及相关11种动物样本,采用本文方法进行复合扩增;并对方法的准确性、灵敏度、稳定性、种属特异性、检材适用性、混合样本的检验等系统性能指标进行验证。结果本文复合扩增系统对最长保存9年的各种血痕检材完整分型成功率为100%,且均衡性良好,无非特异性扩增,口腔拭子的成功率为97.8%,灵敏度达125pg,对含有抑制剂样本,在血红素浓度≤600μmol/L,腐殖酸浓度≤50ng/μL时检出效果稳定,种属特异性好。结论本文24个基因座复合扩增系统在DNA数据库建设中具有较好的应用价值。     

牛的13个STR基因座复合扩增体系的构建及法医学验证

目的 构建一套适用于牛进行个体识别和亲子鉴定的STR基因座复合扩增体系,并对其法医学应用性能进行评估。方法 基于数据库筛选了13个多态性牛STR基因座（TGLA126、BT66、BT165、ETH10、CSSM0113、INRA005、BT54、BT61、INRA023、BM2113、G18833、UMN0929、INRA063）,构建了5色荧光复合扩增体系。对复合扩增体系进行了灵敏度、准确性、均衡性、稳定性、种属特异性、组织同一性和混合样本等验证,并在96例牛无关个体样本中进行了群体遗传学调查。结果 本研究成功构建了一套包含13个多态牛STR基因座的复合扩增体系,该体系灵敏度达125pg,检测同一个体的不同组织、重复检测样本均得到一致的分型结果,检测常见动物样本时未见特异性扩增峰,体系可耐受血红素（≤200μM）、腐殖酸（≤150 ng/μL）、尿素（≤24 000 ng/μL）、靛蓝（≤5 000ng/μL）、黑色素（≤400 ng/μL）等PCR抑制剂。13个STR基因座累计个体识别概率为0.999 999 999 97,累计非父排除概率为0.999 926 668 46。结论 ...     

Amelogenin等位基因丢失的研究现状

Amelogenin基因座作为性别标记包含于常用的商品化STR分型试剂盒中,被应用于法医亲子鉴定、个体识别和DNA数据库等。大量报道显示Amelogenin基因可发生变异,导致X染色体或Y染色体特异性产物扩增失败,即AMELX或AMELY丢失。AMELY丢失可导致性别判断错误,性别错判可误导侦查方向。下面对近年来国内外Amelogenin基因座等位基因丢失现象的研究现状进行综述,探讨Amelogenin基因座的变异频率、变异类型、变异机制及其对性别鉴定的影响和应对方法,为准确地进行法医物证性别鉴定提供帮助。     

荧光标记8个 miniSTR 及 Amelogenin 复合扩增体系的建立

目的建立非CODIS系统miniSTR以及Amelogenin基因座的荧光复合扩增体系。方法筛选8个多态性高的非CODIS系统miniSTR基因座（D20S1082、D6s474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3$4529、D2S441）,并结合Amelogenin基因座设计荧光标记引物,优化反应条件,建立复合扩增体系。应用该体系对204份广州地区汉族血样,30个家系样本,及30份降解检材进行检测。结果建立的荧光标记8个miniSTR及Amelogenin复合扩增体系分型结果明确,稳定性好,且所有片段长度均少于200bp,提高了降解检材的分型成功率。在广州汉族人群的累积个人识别率为0．99999993,累积非父排除率为0．992287。结论构建的miniSTR荧光复合扩增体系,操作简便,分型准确,重复性好,对降解检材有效,易于在法医实验室推广应用,可对现有试剂盒起补充作用。     

PCR-STR技术在交通事故鉴定中的应用

DNA分析技术的应用，为交通事故中肇事车辆的认定提供了另一有效的技术手段。但在实际检案中，交通事故尤其是肇事车逃逸案件能获取的生物学检材常为微量、污染，需与动物成分相区别，且难以满足 RFLPs、 VNTR等方法的检验需要。应用 PCR－ STR技术，选择种属特异性高的 STR基因座，既可对微量、降解生物学检材进行有效 DNA分析又可进行种属鉴定，适合于交通事故生物学检材的个体识别。本文研究了 vWA、 D19S253、 D8S1179三个 STR基因座同步扩增在此类检案中的应用，并对检验过程中一些常见问题进行了分析。 1材料和方法 1.…     

基于切口酶的等温全基因组扩增体系的建立与应用

目的 建立依赖切口酶Nt.BstNBI的等温全基因组扩增体系，并对该体系的微量生物物证STR分型效能进行验证。方法 选用切口酶Nt.BstNBI（识别序列为GAGTC）和等温扩增的聚合酶Bst，建立切口酶依赖的扩增体系（NDA）。对DNA样本进行NDA并纯化NDA产物，对NDA前后的样本进行复合扩增和毛细管电泳，检测该方法的有效性、灵敏性。结果 007标准品12个常染色体基因座的扩增效率提高2倍以上，灵敏度约为3 pg/μL;19个Y染色体个基因座的扩增效率提高2倍以上，灵敏度约为6 pg/μL。8个人血样本扩增效率提高2倍以上的常染色体基因座与007标准品一致。结论 本文建立的NDA体系准确性好，能够对包含特定侧翼序列的STR基因座进行有效的线性扩增，对法医微量生物物证的高效扩增检测具有重要意义。     

2组miniSTR复合扩增体系的建立

本文在参考文献的基础上，建立了两组荧光标记复合扩增体系，分别用于13个miniSTR基因座、1个性别基因座的分型检验，与minifiler试剂盒进行了对比，并对实际案例中微量、高度降解检材进行了检测。     

3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系的构建及应用

目的建立D3S3053、D6S474、D20S482（扩增片段〈150bp）3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系,用于高度降解DNA样本的基因分型。方法采用6-FAM、HEX、TAMRA荧光染料标记D20S482、D3S3053、D6S474基因座上游引物,构建并优化复合扩增体系,在ABI310遗传分析仪上对扩增产物进行电泳分析,Genemapper3．2软件分析产物片段大小并进行分型。采用上述体系对120份河北汉族健康无关个体血样进行检测,并计算群体遗传学参数。比较该体系与ID试剂盒用于高度降解检材的成功率及灵敏度。结果D3S3053、D6S474、D20S4823个miniSTR基因座荧光标记复合扩增分型体系稳定可靠,灵敏度达50pg,用于高度降解检材分析的成功率明显高于ID试剂盒。3个基因座在河北汉族人群中的累积个人识别能力为0．998,累积非父排除率为0．84。结论该系统可用于分析高度降解DNA样本的基因分型,进行法医学个人识别和亲权鉴定。     

DYS19、DYS391、DYS439三个Y-STR荧光标记复合扩增的法医学应用研究

目的　研究Y—染色体STR基因座在法医学检测中的应用价值。方法　用荧光标记DYS19,DYS391,DYS4 39三个Y—STR基因座 ,PCR复合扩增 ,通过毛细管电泳得到结果。结果　三个Y—STR基因座有较高的种属特异性 ;观察 5 0次男性配子细胞形成过程中的减数分裂未发现突变基因 ;对男∶女不同比例混合血样检测 ,当男∶女性血样比达 1∶5 0时 ,仍能准确分型Y—STR基因型 ,并且Y—STR检验较常染色体STR分型更有优势 ;检测了 1～ 15个月病理石蜡切片 ,表明Y -STR基因座适合降解DNA的检测。结论　Y -STR分型适合日常法医检案的需要 ,该方法是对常染色体STR应用的一个补充。     

改良IPEP法用于痕量DNA检测的实验研究

目的探讨改良扩增前引物延伸(IPEP)法对痕量DNA样本STR检测分型的效果。方法用改良IPEP法对痕量样品DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR~ Indentifiler~试剂盒作基因型检测。结果该方法可增加模板DNA约200~1100倍。基因组DNA不低于0.025ng时,可获得15个STR基因座和Amelogenin性别基因座的分型结果。基因组DNA0.01~0.025ng时,可获得9个以上基因座的分型结果。结论改良IPEP法可有效提高痕量DNA样本STR分型检验的灵敏度,有较好的实用价值。     

溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系

目的构建溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系,验证体系特异性并评估其在法医溺死诊断中的应用价值。方法针对溺死相关浮游生物同源基因序列,设计特异性引物,并用FAM、HEX、TAMRA、ROX、SIZ荧光染料分组标记,构建复合扩增体系;进行体系特异性验证;以16例实验猪样本评估体系检验效能;复合扩增体系、硅藻形态学MD-VF-Auto SEM检测法及硅藻rbc L基因PCR-CE检测法分别检测28例案件样本,比较分析应用效果。结果该复合扩增体系共包含14个基因座,可特异性扩增35种浮游藻类和3种浮游细菌,人、3种人体共生菌及8种浮游细菌均为阴性。以该体系检测溺死实验猪,阳性率为90%,非溺死实验猪均未检出;检测溺死案件样本,阳性率为96%,非溺死案件均未检出。复合扩增体系与MD-VF-Auto SEM法检测案件尸体肺、肝和肾的阳性率均不具有统计学差异(P>0.05),但其与硅藻rbcL基因PCR-CE法检测案件肝和肾的阳性率均具有统计学差异(P<0.05)。结论本文针对多种溺死相关浮游生物14个基因建立的复合扩增体系,具备多种靶物种的特异性遗传标记,且所需检材量小,提高了检测效能,在法医溺死鉴定中具有良好的应用前景。