化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。     

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

快速检测奶牛乳房炎四种病原菌的多重PCR方法的建立及应用

奶牛乳房炎是目前世界上困扰奶牛业经济效益及其发展的主要疾病之一。由于现有的检测手段繁琐复杂,所以急需一种特异敏感的检测手段对奶牛乳房炎进行快速、准确的诊断。本试验参照G en Bank发表的序列,在大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌各自保守的16-23S r RN A区域及白色念珠菌的18S r RNA区域设计了4对特异性引物,建立了检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌等4种乳房炎主要致病菌的多重PCR方法。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性和敏感性,对参与试验的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及白色念珠菌均能扩增出各自的阳性条带并且多重PCR检测的敏感度分别为1×102CF U/mL、1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×102 CFU/mL。     

致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种快速鉴别检测致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA和白细胞毒素(lktA)基因保守序列设计特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了鉴别致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法与其他24种常见牛羊细菌均无交叉反应,具有较好的特异性;其检测lktA基因阳性和阴性溶血性曼氏杆菌的最低检出限度均为40 copies,具有较好的敏感性。应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对48份临床样品进行检测,这2种方法检出的溶血性曼氏杆菌阳性率分别为27.1%和18.8%,检出lktA基因阳性溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为20.8%和12.5%,阳性符合率为100%。本研究中建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊溶血性曼氏杆菌致病性与非致病性菌株感染的高通量快速鉴别诊断提供了可行手段。     

嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,标记抗嗜水气单胞菌单克隆抗体并制备金标垫。将吸收垫、喷涂有抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜、金标垫及样品垫组装成免疫层析试纸条,建立嗜水气单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟检测样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示:试纸条对豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与嗜水气单胞菌有特异性反应,检测灵敏度为1×105CFU/mL,检测时间小于5min。所制备的嗜水气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

嗜水气单胞菌Lamp检测方法的建立及应用

基于嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因的序列,设计了1套引物,通过条件优化,成功建立了针对致病性嗜水气单胞菌的环媒恒温基因扩增(Lamp)检测法。采用Lamp法对病原菌进行了扩增,并对病鱼血样进行了检测。结果表明,该法只检出致病性嗜水气单胞菌。对不同浓度的细菌悬液扩增结果表明,Lamp检测嗜水气单胞菌的最低菌液浓度为1.4~14/μL。     

链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的链球菌属保守基因(EF-TU)、猪链球菌种保守基因(GDH)、C群马链球菌兽疫亚种保守基因(M-like)、猪链球菌型特异性基因(SS1型CPS1I、SS2型CPS2J、SS7型CPS7H和SS9型CPS9H)的序列设计合成7对引物,建立了一次性在属、种、型3个水平上检测链球菌猪主要致病种和型(C群马链球菌兽疫亚种和猪链球菌1、2、7、9型)的多重PCR方法。结果显示,该多重PCR在退火温度为61℃时可一次性扩增出7条符合预期大小、序列正确的基因条带;特异性试验和准确性试验结果均符合预期,无非特异性、交叉反应、假阳性、假阴性条带出现;对16株临床分离鉴定链球菌的检测结果与细菌学鉴定及单纯PCR鉴定的符合率均为100%;敏感性为0.08ng/μL;5次重复试验的结果也完全一致。结果表明,建立的多重PCR方法具有高度特异性、准确性、敏感性和稳定性,适用于猪场链球菌病的监控和流行病学快速诊断。     

东北黑熊粪肠球菌PCR检测方法的建立及应用

为建立一种基于细菌16S r DNA的粪肠球菌PCR检测方法,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,通过死亡黑熊脏器中提纯的粪肠球菌测序结果与NCBI中的粪肠球菌16S r DNA序列(登录号:NZ_AJXO01000024.1)的比对,设计了1对特异性PCR引物,并对PCR反应条件、敏感性和特异性进行了测定。结果表明,扩增条带与预期的产物大小一致,经过测序结果分析,证明该条带为目的条带,其他种属的菌株未见条带;并且当引物工作剂量为0.2 L、酶工作剂量为0.15 L就可以扩增出清晰的目的条带,该方法的最小检出量为86 CFU;通过对13头份来自延边熊场的患病(4头)和健康(9头)黑熊粪便检测,患病样本检验结果均为PCR阳性,表明该特异性PCR诊断方法能简易、快捷地检测粪肠球菌,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供理论依据,同时也为黑熊疾病的防治奠定了临床基础。     

检测987p+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88 ( 为菌毛阳性 )、K 99 、F 41 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床 987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查     

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

耐氟喹诺酮类病原菌gyrA基因突变的寡核苷酸芯片检测

根据大肠杆菌、沙门菌、无乳链球菌和鸡毒霉形体的gyrA基因序列,设计了通用引物和11条寡核苷酸探针;利用点样仪将探针点在基片上,制成寡核苷酸芯片;采用PCR荧光标记靶基因,与芯片杂交,用荧光扫描仪检测信号;同时以PCR-测序法进行gyrA基因突变的检测。结果,PCR反应体系能特异性地扩增出靶基因;寡核苷酸芯片能同时检测不同病原菌GyrA第83、87位发生的突变,芯片检测结果与测序结果较为一致。结果表明,使用寡核苷酸芯片技术检测病原菌耐氟喹诺酮类基因突变是可行的;研究结果为基因芯片技术应用于兽医临床耐药性检测提供了基础。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

IBV青岛腺胃分离株S1纤突蛋白基因的克隆与鉴定

参考Genebank发表的传染性支气管炎病毒(IBV)S1纤突蛋白基因序列,自行设计合成了1对引物,对IBV青岛腺胃分离株(SD/97/02)RNA进行RT-PCR扩增.产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条1657 bp的条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,证实为S1基因.将此重组质粒命名为pMDQXS1.     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。     

7种动物冠状病毒基因芯片同步检测的研究

根据发布的7种动物冠状病毒相关基因的序列,给每种病毒设计了4~17对引物,同时依据RNA聚合酶基因序列合成了1对兼并引物,利用TCV原毒和纯化浓缩的CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV、BCV细胞毒,构建了89个基因片段的克隆。采用煮沸裂解法制备质粒DNA,进行特异引物PCR扩增,回收纯化产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,同时对BCV、CCV利用Cy3-dCTP随机渗入反转录标记,与芯片进行杂交检测。结果显示,BCV和TCV基因克隆间未见交叉,CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV则存在广泛交叉。选择无交叉的特异克隆片段点制最终基因芯片,并与病毒多重PCR扩增产物杂交,芯片信号未见交叉,结果判断明确。表明,基因芯片检测法比传统PCR法敏感1 000倍。