以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因 DNA疫苗猪体免疫试验

给猪口服和肌肉注射以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因DNA疫苗(L.acido SFMD-1),以正向间接血凝试验(IHA)和MTT方法分别检测了免疫后FMDV VP1抗体的动态变化和特异性T细胞增殖反应情况,并与商用FMD油佐剂疫苗、裸质粒FMDV VP1基因DNA疫苗诱导的特异性免疫抗体水平进行了比较。结果显示,口服组猪在免疫后第21d抗体效价达到了1∶2~(7.7),而肌肉注射组猪为1∶2~(3.3)。加强免疫后2周,口服免疫组抗体水平下降到1∶2~(5.3),到第3周快速上升到1∶2~8；与此相对应,肌肉途径免疫组猪抗体效价缓慢地从1∶2~(5.3)上升到1∶2~(6.7)。口服途径和肌肉注射途径的刺激指数(SI)分别为1.93和2.00,2种免疫途径都可以诱导特异性T细胞增殖反应。证实,该疫苗能够在猪体诱发VP1特异性T细胞和B细胞反应,以乳酸杆菌为载体是DNA免疫和预防猪口蹄疫的一种极有前景的方法。     

IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗佐剂的免疫效应研究

为了评估IFN-λ1作为免疫佐剂能否提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应,利用RT-PCR方法扩增猪源IFN-λ1基因,构建重组真核表达载体pVAX1-IFN-λ1,通过Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定免疫效果。结果表明,转染pVAX1-IFN-λ1重组质粒的BHK21细胞能够正确表达IFN-λ1;将重组IFN-λ1与p VAX1-prME DNA疫苗免疫小鼠后,与对照组p VAX1-prME相比,IFN-λ1可以诱导小鼠产生乙型脑炎病毒EⅢ蛋白特异性抗体水平、乙脑病毒特异性中和抗体效价和淋巴细胞增殖水平显著提高。结论,重组猪源IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗的分子免疫佐剂能够在小鼠动物模型上提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应。     

鸭源大肠杆菌与多杀性巴氏杆菌融合菌株DB4免疫原性的研究

本研究旨在评价融合菌株DB4的免疫原性以及对亲本大肠杆菌ZYD2(O78)株、亲本多杀性巴氏杆菌YB2(5∶A)株的攻毒保护力。制作DB4蜂胶灭活疫苗分为一免组、二免组对鸭进行免疫,对两组鸭的血清抗体效价、IL-4和IFN-γ水平、外周血淋巴细胞增殖活性、白细胞吞噬活性进行测定,并于首免后2周以大肠杆菌ZYD2(O78)、多杀性巴氏杆菌YB2(5∶A)攻毒。结果显示,DB4能够诱导鸭产生两种亲本抗体,效价达1∶29、1∶28,同时能刺激淋巴细胞增殖活性和白细胞吞噬活性,免疫后刺激指数增加3倍,与对照组差异显著(P0.05),白细胞吞噬率升高30%,血清中IL-4和IFN-γ含量分别高于对照组33.5、12.5 ng/L,可抵抗亲本菌株的攻击,保护率80%,表明DB4具有良好的免疫原性,可应用于研制大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌二联疫苗。     

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。     

牛源金黄色葡萄球菌FnBPAA基因与D基因表达产物的免疫原性比较

为评价金黄色葡萄球菌黏附素蛋白FnBPA A和FnBPA D基因表达产物的免疫原性,分别用纯化的重组原核表达蛋白FnBPA A和FnBPA D免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测免疫家兔血清的抗体效价,用双抗体夹心法检测细胞因子的表达水平及进行全血调理吞噬试验。结果显示,在三免后第7天抗体水平分别可达1∶12 800(FnBPA A)、1∶25 600(FnBPA D),并且FnBPA A免疫组的全血杀菌能力优于FnBPA D免疫组;同时,两者均能提高家兔体内IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平,且FnBPA D组显著高于FnBPA A组(P0.05)。结果表明,FnBPA D基因较FnBPA A基因更适合作为奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗的候选基因。     

羊口疮病毒F1L与B2L基因核酸疫苗联合免疫小鼠特性的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)F1L与B2L基因核酸疫苗PVAX1-F1L、PVAX1-B2L联合免疫小鼠诱导体液和细胞免疫的应答效果,分别将PVAX1-F1L+PVAX1-B2L、PVAX1-B2L、PVAX1-F1L、PVAX1空载体与PBS通过后腿肌肉注射方式免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫不同时间段的小鼠血清中OrfV特异性抗体及细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ,并通过MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ细胞因子水平显著(P<0.05)高于PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组,IL-4细胞因子水平差异不明显,但均与PVAX1空载体和PBS组差异极显著(P<0.01);PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平与PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组相比,差异显著(P<0.05),与PVAX1空载体和PBS组相比,差异极显著(P<0.01)。结果表明,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫小鼠能够增强OrfV特异性抗体的分泌和细胞免疫应答,这为羊口疮新型疫苗的研制奠定了理论基础。     

猪瘟流行区仔猪免疫程序的研究

将配种前猪瘟疫苗免疫母猪所产仔猪分为 4、2、2头份和 4、4、4头份 2组 ,分别于 2 5、40、60日龄进行首免、二免和三免 ,并在 3 9、5 8、90、180日龄时 ,用IHA法检测血清抗体水平。结果 ,2组猪的群体阳性率分别为 90 .6%、92 .6%、96.2 %、88.0 %和 93 .8%、88.9%、10 0 %、88.0 % ,平均抗体效价分别为 1∶10 3、1∶96、1∶15 9、1∶2 2和 1∶85、1∶85、1∶15 0、1∶64 ,2组之间差异不显著 (P >0 .0 5 )。该免疫程序经在猪瘟流行的某规模化猪场采用后迅速、有效地控制了疫情。证明该程序在生产中应用是可行的 ,比乳前免疫操作简便、效果可靠     

真核表达的吕氏泰勒虫TlSP重组蛋白的免疫保护效果评价

为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵羊的临床症状、红细胞染虫率和特异性抗体效价等来评价免疫保护效果;空白对照组以等量PBS代替抗原进行同步参照分析。结果显示,空白对照组的绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等典型的临床症状,而2个重组蛋白免疫组只出现轻微贫血。空白对照组、免疫A组(600 g)和免疫B组(300 g)分别于攻蜱后第20天、36天和29天最早发现血液中出现泰勒虫,最高染虫率分别为8.60%、1.12%和3.00%,特异性抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。本研究为今后羊泰勒虫病的防治奠定了基础。     

雏番鸭细小病毒疫苗在产蛋母鸡体内诱导的免疫动态研究

采用雏番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus,MPV)油乳剂灭活疫苗、弱毒疫苗及油乳剂灭活疫苗+弱毒疫苗分别经肌肉接种非易感动物--成年产蛋母鸡,并定期采血检测试验鸡的T、B淋巴细胞百分比值和MPV特异沉淀抗体的动态变化.结果,油乳剂灭活疫苗组产蛋母鸡T、B淋巴细胞比值从免疫前1周的常值28.50%上升到三免后1周的峰值46.30%;特异沉淀抗体从免疫前的常值0上升到三免后2周的峰值134.6.弱毒疫苗组产蛋母鸡T、B淋巴细胞比值从免疫前1周的常值27.83%上升到三免后1周的峰值39.17%;特异沉淀抗体从免疫前1周的常值0上升到三免后1周的峰值116.油乳剂灭活疫苗+弱毒疫苗组产蛋母鸡T、B淋巴细胞比值从免疫前1周的常值28.60%上升到三免后1周的峰值45.67%;同期其特异抗体由0升至164.结果表明,MPV各种疫苗均可以诱导产蛋母鸡产生明显的免疫应答,包括体液免疫与细胞免疫,其中效果最显著的是由油乳剂灭活疫苗+弱毒疫苗诱导的免疫应答.     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a( )中,得到重组质粒pET64-85。该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21(DE3)转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2 螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

黄牛感染人乙型肝炎病毒的研究

人乙型肝炎是危害人体健康的主要传染病。本试验在黄牛猝死症死亡牛的肝脏中,通过反向血凝试验及电镜观察,有6头牛的肝脏检出人乙型肝炎病毒。并对曾与阳性病死牛同槽饲养牛的20份血清检测,乙肝表面抗原阳性4份,e抗原阳性3份,表面抗原抗体阳性7份,抗e抗体阳性17份,抗核心抗体阳性9份。同槽饲养中感染率为85％。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

乳牛咽后淋巴结内S-100阳性树突状细胞的分布

采取10头健康乳牛的咽后淋巴结,按常规制备石蜡切片,用兔抗牛S-100多克隆抗体进行免疫组织化学染色,观察了健康乳牛咽后淋巴结内树突状细胞(DC)的分布。结果显示,在咽后淋巴结中,S-100+DCs不仅分布在皮质,而且在髓质中也有大量分布;在被膜下窦内也有S-100+DCs,在皮质的最外层有较多的S-100+DCs;在淋巴滤泡中,滤泡树突状细胞(FDCs)呈S-100阳性标记,而在淋巴滤泡之间则有少量的S-100+DCs;髓质中有大量的S-100+DCs,多数呈贴壁分布,少数散布在窦腔内。表明,在正常乳牛咽后淋巴结内就有树突状细胞分布,一群是皮质树突状细胞,另一群是髓质树突状细胞。     

单克隆抗体鉴定的鸡T细胞体内功能特性试验

对鸡Ｔ细胞特异性单克隆抗体１Ｂ６鉴定的Ｔ细胞亚群进行了体内功能试验，表明１Ｂ６＋Ｔ细胞缺陷鸡接种新城疫ＬａＳｏｔａ疫苗后，抗体效价明显降低，证明１Ｂ６＋Ｔ细胞具有辅助Ｂ细胞产生抗体的重要功能。     

奶牛乳房炎四种致病菌PCR核酸免疫层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为了开发检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌这四种重要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法,本研究采用柠檬酸还原法制备10 nm的胶体金溶液,选用优化的10μL 1 mol/L碳酸钾溶液调节pH和5μL异硫氰酸荧光素抗体偶联金颗粒,并使用优化的封闭液(10%BSA、0.25%PEG2000、0.05%吐温-20、0.05%Triton-X100)进行封闭,将地高辛抗体和山羊抗鼠二抗分别喷涂在检测线和质控线上,烘干并组装成试纸条,进行细菌的纯培养物和鲜牛奶加样检测。结果显示,所制备的PCR核酸免疫层析试纸条和凝胶电泳均具有较好的特异性,最低检测限要比凝胶电泳高10倍,在模拟污染牛奶样品测试中,试纸条仍然具有很好的特异性且灵敏度比凝胶电泳的高。上述结果表明,本研究建立的PCR核酸免疫层析试纸条检测方法具有良好的临床应用潜力。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM IMC2 .2 重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10 2 0 0 gp85基因 ,构建了转移载体pFastBacl IMCgp85 ,并利用Bac to Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac IMCgp85。转染Sf 9细胞后的表达研究表明 ,重组杆状病毒可高效表达IMC10 2 0 0 的gp85基因 ,表达产物具有病毒的抗原特异性 ,与ALV J单抗JE 9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明 ,表达产物的分子质量约 5 4ku。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

2005年上海地区乳牛球虫感染的季节动态

为了解上海地区乳牛球虫感染的季节变化情况,对上海地区3个牧场乳牛抽样直肠采集粪便,检查了718头乳牛粪样。结果,查出球虫阳性牛269头,平均感染率为37.46%,其中1月龄以内牛的感染率为33.89%,1~12月龄牛的感染率为42.33%,12月龄以上牛的感染率为25.95%。平均感染率最高的4月份为44.44%,最低的8月份为28.57%。3个牧场球虫阳性牛的感染强度(OPG值)为0~169 000个,平均OPG值为9 477个,其中1月龄以内牛的OPG值为8 270个,1~12月龄牛的OPG值为4 318个,12月龄以上牛的OPG值为145个。调查发现了6种球虫,分别是牛艾美球虫(Eimeria bovis)、椭圆艾美球虫(E.ellipsoidalis)、邱氏艾美球虫(E.zurnii)、怀俄明艾美球虫(E.wyomingensis)、柱状艾美球虫(E.cylindri-ca)、亚球形艾美球虫(E.subspherica)。结果表明,2005年上海地区乳牛球虫感染率无明显季节差异,12月龄内乳牛的球虫感染率与感染强度均明显高于12月龄以上乳牛,乳牛球虫的优势虫种为牛艾美球虫、椭圆艾美球虫、邱氏艾美球虫。