小鼠LRRFIP1基因的克隆及LRRFIP1天然免疫模式识别功能的研究

应用RT-PCR技术,从小鼠脾淋巴细胞中成功克隆了LRRFIP1基因,并对其遗传演化关系及LRRFIP1的分子结构特征进行了分析。结果显示,克隆的基因开放阅读框全长2 190bp,编码729个氨基酸,与大鼠、猪、牛等哺乳动物LRRFIP1相应序列的同源性为90.5%~46.5%。将克隆的小鼠LRRFIP1基因亚克隆至真核表达载体pCMV-Tag 2B,转染HEK293T细胞后,双荧光素酶报告系统证实,在poly(dA-dT)和poly(dG-dC)刺激下,过表达小鼠LRRFIP1能够通过激活IRF3而显著增强IFN-β的表达。结果表明,小鼠LRRFIP1能够识别富含A/T或C/G的DNA序列,在宿主抗DNA病毒感染的天然免疫反应中可能发挥重要作用。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

鸡Toll样受体3基因全长的扩增及生物信息学分析

利用RT-PCR方法从广西三黄鸡外周血淋巴白细胞中扩增出鸡Toll样受体3基因(TLR3),进而对其进行序列分析和结构预测。结果显示,扩增出的TLR3基因全长为3 036bp,与GenBank中鸡TLR3序列同源性达96.5%～99.7%,突变主要集中在胞外区前173个氨基酸;与牛、鼠、绵羊、猪、马、家兔、黑猩猩、人、大猩猩的氨基酸同源性较低,为68.0%～74.8%;禽类TLR3与其他动物类及人类的TLR3分属于两大不同分支,处于不同进化位置;结构预测表明,GX-sh-chTLR3具有明显的跨膜蛋白结构,胞外区蛋白是由外侧多个α螺旋和内侧凹陷的多个β折叠构成螺线管状马鞍形结构,胞外区含有15个明显的富含亮氨酸的重复序列。结果表明,成功扩增出的鸡TLR3基因编码蛋白的空间结构特征明显,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

武威驴PrP基因序列与结构特征的分析

以武威驴朊蛋白(PrP)基因序列与结构特征分析为基础,通过比对找到奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因的差异,探究朊病毒病在奇蹄动物与偶蹄动物之间传播的种间屏障及其形成机制。分别从8头武威驴全血中提取基因组总DNA,用设计的特异性引物以聚合酶链反应扩增出细胞型朊蛋白基因(PrPC),并将其克隆到pGEM-T Easy载体。测序之后使用生物信息学方法与软件进行相关分析。序列测定分析表明,所克隆的武威驴PrP基因片段的大小为768bp,包含了驴PrP基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框。本次克隆的武威驴PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码九肽/八肽PQGGGGWGQ/PHGGGWGQ重复子。8个驴PrP基因之间核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别介于99.2%~99.8%和98.4%~100%之间。武威驴与西吉驴、马之间PrP基因序列的同源性分别为99.2%和98.7%,与牛、绵羊、马之间PrP基因C端约100个残基区域的三级结构的相似性分别为91.84%、92.04%和97.35%。结果表明,奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因存在明显的差异与进化分歧。     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。     

口蹄疫病毒受体牛源β1亚基基因的分子特征

从口蹄疫病毒试验感染康复牛肺组织中克隆了β1亚基基因,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行了比较分析。结果显示,牛β1亚基基因的编码区含有2 397个核苷酸,编码798个氨基酸,含有10个潜在的糖基化位点,其中信号肽由20个氨基酸组成,胞外域由708个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞浆域由41个氨基酸组成。与GenBank中的牛β1基因的同源性达99.5%,从起始密码子开始共有12个碱基发生了变化,引起第217、247、268、281、321、691、709位的氨基酸改变,分别由F、S、W、V、H、Y、V变为S、P、R、G、Y、C、G。牛β1基因与猪、猩猩、猫、犬、人、小鼠和鸡的β1基因核苷酸序列同源性分别为93.8%、89.3%、91.6%、90.2%、89.6%、85.4%、75.6%,推导氨基酸序列同源性分别为98.2%、93.7%、97.5%、96.7%、94.2%、93.2%、84.1%。牛与猪β1亚基同源性最高。     

牛带绦虫8ku蛋白基因家族cDNA的克隆和序列分析

根据带科绦虫8ku蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对牛带绦虫六钩蚴总RNA进行扩增,扩增产物经胶回收试剂盒纯化,与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,筛选含有阳性重组DNA的克隆,对阳性克隆进行测序。使用DNAStar和MAGE 4生物学软件对基因克隆进行序列分析和进化树分析。结果显示,成功克隆了5种牛带绦虫8ku蛋白基因家族新成员,cDNA序列完整开放阅读框的大小为258bp,TSA8ku-1cDNA为优势克隆。序列同源性分析表明,各cDNA克隆氨基酸序列之间的差异性为1.2%～14.2%,与猪带绦虫诊断抗原TsRS1群(组)成员同源,相似性为85.9%～88.9%。由此可以推测,克隆的5种8ku蛋白基因家族成员可能是牛带绦虫病的重要诊断抗原候选基因。     

棕蓑猫蛔虫ITS及5.8S rDNA序列的克隆与分析

以分离自广州动物园棕蓑猫体内的蛔虫为研究对象,用保守引物NC5和NC2对核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增,扩增后的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对其进行序列测定及分析,旨在鉴定棕蓑猫蛔虫的种类。结果显示,目的片段ITS总长为907bp,2个不同样品之间的ITS序列没有差异,与狮弓蛔虫、猫弓首蛔虫和犬弓首蛔虫的ITS-1序列相似性分别为96.9%、71.3%和73.2%;5.8S序列的相似性分别为100%、95.5%和96.8%;ITS-2序列与GenBank中的狮弓蛔虫序列的相似性为94.3%,与猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫序列的相似性均小于60%。结果表明,此次分离的棕蓑猫蛔虫属于狮弓蛔虫。     

合作猪TLR3及其剪接体的基因克隆与序列分析

为了研究猪Toll样受体3(pTLR3)基因的选择性剪切机制,应用反转录-聚合酶链反应扩增技术,从猪外周血淋巴细胞中克隆了pTLR3及其剪接体基因(pTLR3a,pTLR3b)。pTLR3基因序列分析表明,克隆的基因ORF为2 718bp,编码905个氨基酸;推导的氨基酸序列分析显示,在其胞外区具有LRRs结构域,胞内区含有TIR结构域,具有TLR家族的典型结构特征。剪接体分析显示,pTLR3a和pTLR3b基因缺失第3外显子,都没有可编码跨膜区、胞内区的部分。相似性分析显示,与牛、马、猫和人的相似性较高,与家兔、鼠的相似性次之。证实pTLR3可变剪接体的存在为进一步研究其功能奠定了基础。     

我国羊巴贝斯虫bov57基因的结构与遗传进化分析

通过对我国羊巴贝斯虫bov57基因进行克隆、序列比对和进化分析,为研究bov57基因功能及我国羊巴贝斯虫分类提供基础数据支持。以NCBI数据库中公布的卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫bov57基因序列BLAST我国2个羊巴贝斯虫基因组数据库,获得羊巴贝斯虫bov57基因的保守序列,以此为模板设计引物;扩增我国6株羊巴贝斯虫的bov57基因,分析其结构特征,并进行序列比对,构建系统进化树,分析遗传进化关系。结果显示,这6株羊巴贝斯虫bov57基因均无内含子,羊巴贝斯虫未定种敦煌株/新疆株(BspDH/XJ)和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株(Bm LT/TZ)bov57基因ORF的大小为1 608 bp,编码536个氨基酸;莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株(Bm HB/NX)bov57基因ORF的大小为1 605 bp,编码535个氨基酸。序列比对结果显示,羊巴贝斯虫未定种与莫氏巴贝斯虫bov57基因核苷酸序列的相似性为58.84%～61.71%,氨基酸序列的相似性为45.93%～50.93%;莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株的核苷酸序列相似性为85.29%～85.60%,氨基酸序列相似性为75.19%～75.74%。遗传进化分析结果表明,我国的这6株羊巴贝斯虫分为2个种,而莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种。     

牦牛β-干扰素基因的克隆与表达

提取经植物血凝素(PHA)诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因,经PCR和酶切鉴定及测序分析,再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中,构建了原核表达重组载体,经IPTG诱导表达重组蛋白,可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白,主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明,牦牛IFN-β基因ORF为498 bp,与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98.6%,与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25%;分子遗传进化树分析也表明,牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远,说明IFN-β基因有种属差异性。     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的克隆与序列分析

以外周血液的基因组DNA为模板,运用PCR方法扩增了食蟹猴和猕猴的朊蛋白基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体中进行测序,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析.结果表明,所克隆的食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的开放阅读框片段包含了朊蛋白基因的完整编码区,含有762个核苷酸,该基因内无内含子,编码253个氨基酸的前体蛋白,推测其分子质量约27.6 ku.与已报道的其他多种动物朊蛋白基因序列做比较,发现其与多种哺乳动物都有较高的同源性,其中与人的同源性最高.氨基酸点突变分析除发现了已报道的多态性位点N97S、H100N外,在食蟹猴和猕猴均发现了未报道的S242L点突变位点.此外,在食蟹猴还发现了I8M、C151R点突变位点.     

环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞中galectin-1基因的原核表达与鉴定

为了获得重组牛半乳糖凝集素1(galectin-1),从被环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用RT-PCR扩增galectin-1基因。将目的片段连接到载体pET-30a(+)上,并转化入表达菌BL21(DE3)中,经PCR、酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和His-NiResin蛋白纯化。SDS-PAGE结果表明,获得了约17ku的表达产物。Western-blot分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、绵羊抗牛半乳糖凝集素1多克隆抗体均能发生反应。重组半乳糖凝集素1的多克隆抗体也可以较好地识别天然蛋白。本试验成功表达了牛半乳糖凝集素1,并制备了其多克隆抗体,为以后进行与半乳糖凝集素1相互作用蛋白的研究奠定了基础。     

绵羊CD46基因的克隆及真核表达

为了研究绵羊CD46蛋白的功能,根据从GenBank数据库获得的绵羊CD46基因的部分cDNA序列设计引物,以绵羊外周血淋巴细胞总RNA为模板,应用RACE方法扩增了绵羊CD46基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对CD46cDNA及CD46蛋白结构进行了预测分析。结果显示,绵羊CD46cDNA序列开放阅读框长1 083bp,编码由360个氨基酸残基组成的多肽,该多肽的理论分子质量为39ku,理论等电点为6.5。对该蛋白结构分析时发现,绵羊CD46第1~42位氨基酸残基为信号肽序列,共有5处N糖基化位点,4处蛋白激酶C磷酸化位点,5处Ⅱ-酪蛋白激酶磷酸化位点,7处N-豆蔻酰化位点。二级结构中无α螺旋,β折叠占26.1%,其余73.9%为转角,该蛋白具有4个结构域,与人源CD46的同源性较高。同时将CD46基因克隆到pCMV-Myc载体中,构建了真核表达质粒pCMV-Myc-CD46;将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞CHO-K1以进行瞬时表达。Western-blot结果显示,CD46基因在真核细胞中成功获得了表达。上述研究结果为以后开展绵羊CD46的功能研究奠定了基础。     

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 ,可作为ELISA包被抗原     

狂犬病“靶向性”Th表位DNA疫苗的构建与瞬时表达研究

用RT-PCR扩增BALB/c小鼠P31基因,在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;采用定向克隆方法将狂犬病病毒核蛋白、糖蛋白及NS蛋白主要Th抗原表位核苷酸序列替换P31序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应获得带有Kozak调控序列的P31-Th分子,以增加目的基因的表达量,并将含有Kozak序列的P31-Th分子克隆入真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各Th表位表达载体转染COS-7细胞,Western-blot检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果表明,BALB/c小鼠P31基因CDS区长648bp,编码215个氨基酸,与Gen-Bank中登录的Ii分子（NM₀10545）的核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P31分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明,成功构建了携带P31-Th分子的真核表达载体;Western-blot分析证实,各P31-Th分子均在COS-7细胞中获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P31多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,作者成功构建了狂犬病病毒主要Th抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。     

牛肌肉生成抑制素基因功能区的克隆与原核表达

根据GenBank中牛肌肉生成抑制素(MSTN)基因序列设计了1对引物,在引物两端分别加EcoR I和Xho I识别位点。利用RT-PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体,酶切、PCR鉴定及测序分析表明,该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌,经IPTG诱导,牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR技术扩增并克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)NH36编码基因,经鉴定及序列分析,构建其原核重组表达载体,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定其表达产物。结果显示,获得的NH36开放阅读框为945 bp,编码314个氨基酸残基,与GenBank上发表的国际标准株NH36编码基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88.57%(837/945)和89.17%(280/314)。表达蛋白为36 ku,经1 mol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高;薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57%;该蛋白可被抗杜氏利什曼原虫的多克隆抗体血清识别。