猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析

从内蒙古某猪场患高热症病猪病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变.经RT-PCR法鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为NM1.应用设计的特异性引物扩增NM1株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较.结果表明,NM1株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株HUN4、HuB2、JXA1的核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%.动物回归试验结果显示,人工感染的5头仔猪全部发病,其中3头死亡,说明NM1株为发生变异的PRRSV,其致病力有所增强.     

LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响

应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒的变异分析

为了解河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR方法对2004～2007年采集的12个典型发病场的病料样本进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和DNAMAN软件对所测序列进行了分析.结果显示,扩增的ORF5基因氨基酸序列同源性为98.7%～100%,与美洲型和欧洲型PRRSV参考株的同源性分别为88.9%～100%和62.9%～63.5%;扩增的Nsp2基因氨基酸序列同源性为82.8%～100%,与参考毒株的同源性为76.5%～100%;从2006~2007年的样本中扩增的6个PRRSV Nsp2基因均在第481位和533~561位共缺失30个氨基酸;系统进化树分析表明,这6个样本株均属于美洲型,分属于2个基因亚群,其中HB0503株与BJ4、NJ1、HN1、LP1和VR-2332遗传关系较近,其他株与JXA1、SX和BJ株遗传关系较近.结果表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004～2005年的样本株属低致病性PRRSV毒株,而2006～2007年的样本株属高致病性PRRSV毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白基因核酸序列设计引物,经BLAST比较发现,该引物既可以扩增较早发现的PRRSV毒株,也可以扩增近期发现的在Nsp2基因上有较大变异的PRRSV毒株,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立了检测PRRSV的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法.结果表明,该方法标准曲线的相关系数大于0.99,敏感性可以达到1×101拷贝/μL,约为普通PCR的100倍;用该方法检测人工感染PRRSV的猪全血,结果阳性检出率为100%.敏感性、特异性和稳定性试验表明,该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性,可以用来快速检测PRRSV.     

2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析

为了解重庆市PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2006～2008年分离到的14株重庆市内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和0RF5基因序列的测定和分析.结果显示,与2006年以来国内流行的变异毒株相比,Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到97.3%～99.5%和98.2%～99.7%,这2个基因推导的氨基酸序列同源性分别达到95.7%～99.2%和98.0%～99.5%.与传统毒株相比,Nsp2和ORF5基因及其推导的氨基酸都存在点突变,并在Nsp2基因内部存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失,ORF5基因未存在缺失.从遗传进化以及变异情况看,重庆市流行的PRRSV主要为变异毒株,属于美洲型中的亚群Ⅱ.     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

猪非典型瘟病毒GX01-2018株全基因组分子特征的分析

猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因组全长11 565 bp,包括一个编码3 635个氨基酸的阅读框(ORF)。同源性分析显示,GX01-2018株与国内代表毒株广西GX-CH_2016株、江西JX-JM01-2018A01株、广东China/GD-SD/2016株、广东GD株核苷酸序列的同源性分别为98.2%、92.9%、83.4%、90.8%。GX01-2018株与国外代表毒株美国000515株、德国Bavaria_S5/9株、奥地利AUT-2016_C株、荷兰NL1株核苷酸序列的同源性分别为87.8%、90.7%、90.5%、90.7%。上述国内外代表毒株间Npro、Erns、E2基因核苷酸序列的同源性分别为79.1%～97.2%、83.0%～98.4%、83.1%～96.8%。基于APPV全基因组以及E2、Npro、Erns基因核苷酸序列绘制遗传进化树,获得相似的进化树图。来自广西的GX01-2018株与欧洲型毒株位于一个分支,而同样来自广西的GX04/2017株与美洲型毒株位于另一个分支。表明APPV流行毒株具有遗传多样性,来自同一地区的流行毒株出现较大的遗传变异。     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.     

通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆

根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GSWW分离株的全长基因组序列信息,采用合成生物学的方法,将全长基因组序列分为两段(7 636 bp和7 774 bp)分别连接到低拷贝载体p BR-322载体中,然后将2个半长片段相连接得到全长c DNA克隆。将质粒线性化后,体外转录获得全长RNA,经电穿孔转染BHK21细胞拯救获得了初代病毒。将初代病毒接种感染Marc-145细胞进行传代,接毒后第36小时即可观察到完全的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证,证明成功获得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒与原田间分离毒的复制能力,没有显著差异,采用实时荧光定量法测得的拯救病毒复制的最高效价为1×1010copies/m L。本研究表明,采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建,方法可行且速度快,为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。     

猪IFN-β免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD07株在Marc-145细胞中在添加或不添加猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力条件下连续传代,将获得的新毒株进行病毒生物学分析、序列测定和IFN-βmRNA水平检测。结果显示,传代后病毒效价逐渐降低,swIFN-β对自然传代和免疫压力下传代毒株的抑制作用下降,且对swIFN-β免疫压力下传代毒株的抑制作用下降的程度较大。序列分析表明,ORF3和ORF5序列的变异导致氨基酸发生变异。荧光定量RT-PCR检测表明,swIFN-β免疫压力下传代病毒感染Marc-145细胞的IFN-βmRNA水平低于自然传代毒株的相应指标,两者均远低于poly(I∶C)刺激细胞后的IFN-βmRNA水平。结果表明,swIFN-β免疫压对PRRSV的遗传变异有正向加速作用。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

虎源副流感病毒5型的分离鉴定及全基因序列分析

本研究旨在了解虎源副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)的遗传变异情况,阐明其基因组与遗传进化等特征。从广东省某动物园疑似虎PIV5感染的病料处理后接种Vero细胞并通过一系列的鉴定,将分离的毒株命名为HMZ。根据GenBank中PIV5基因序列,设计包含全长的12对特异性引物,并扩增其全基因组。将扩增产物克隆到pMD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序,并对基因全序列进行同源性分析及遗传进化分析。结果显示,HMZ与各病毒株全基因序列同源性为97.2%～99.8%。其中与1168-1 (KC237064.1)、ZJQ-221 (KX100034.1)以及Mammalian rubulavirus 5 (KY685075.1)亲缘性最高,为99.8%;而与D277的亲缘性最低,为97.2%。全基因系统进化树分析结果表明,HMZ与ZJQ-221、Mammalian rubulavirus 5属于同一分支。     

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR检测,确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将此细胞病毒液命名为GDB1,用其感染回归5头40日龄健康仔猪,采集发病及死亡猪组织,重新用Marc-145细胞进行病毒分离,将再次分离到的病毒命名为GDB1F.对GDB1、GDB1F的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析.结果表明,单独感染猪2/2发病死亡,同居感染的3头猪全部发病,2头死亡;感染后2～4 d所有感染猪均出现体温升高.死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎,肢体远端皮表出血.序列分析结果表明,GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2 Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高,达98.4%～99.0%.GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97.5%～99.8%.     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒四川株的分离鉴定及Nsp2生物信息学分析

为了解四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况及分子特征,本研究选用2012—2014年四川省不同地区采集并诊断为PRRSV阳性的病料,以Marc 145细胞进行病毒分离,经蚀斑纯化,病毒基因扩增、测序后与NCBI现有序列进行比对分析并通过构建系统进化树等方法研究分离株的分子特征。共成功分离到10株PRRSV,分析证明所有分离毒株均是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)株,序列比对显示,其中SC2012、SC2012-2株Nsp2部分基因与众多HP-PRRSV株核苷酸同源性在91%~97%之间,与经典毒株CH-1a株同源性为72.9%,与所有BLAST毒株相比存在新缺失位点,与CH-1a、BJ-4株相比,在Nsp2蛋白485 aa~498 aa处存在14个连续氨基酸缺失,其他8株均含30个不连续氨基酸缺失。氨基酸同源性比对显示,SC2012、SC2012-2株高变区与国内分离株同源性介于61.5%~97.2%之间。通过TCID50法测得SC2012、SCSN2012-1、SCSN2012-2、SCCD2012、SCLS2012、SCMY2012、SCBZ2012、SCXC2012、SCXJ2012和SC2012-2病毒毒价分别为10~(-5.41)/m L、10~(-6.5)/m L、10~(-7.29)/m L、10~(-6.41)/m L、10~(-5.5)/m L、10~(-7.67)/m L、10~(-6.29)/m L、10~(-6.8)/m L、10~(-7.41)/m L和10~(-6)/m L。以上结果表明,本研究所分离的SC2012、SC2012-2株是新变异毒株,为四川省PRRSV分子流行病学和遗传变异研究奠定了一定基础。