从聚丙烯酰凝胶中回收DNA片段直接PCR的简易方法

将聚丙烯酰胺凝胶中ＤＮＡＳ片段于ＰＣＲ缓冲液中洗脱，加入ＰＣＲ反应试剂直接扩增目的ＤＮＡ作进一步分析，ＤＮＡ片段回收效率为０．８９±０．０５，本方法简便、快速。     

H9N2亚型禽流感病毒聚合酶基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对1株H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA分别进行了扩增,将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒的PB2、PB1和PA基因开放阅读框(ORF)分别由2280、2274和2 151个碱基组成,分别编码759、757和716个氨基酸。经同源性与系统发生树分析,该毒株RNA聚合酶基因PB2、PB1和PA与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性均在98%以上,另外这3个基因与Dk/HK/Y280/97、Sw/HK/9/98和Qu/HK/NT/28/99株的关系密切。     

用多聚酶链反应检测非洲猪瘟病毒的研究

用HindⅢ对非洲猪瘟病毒核酸的重组质粒pRPEL2进行酶切后,将第5片段插入到pT7/T3α-19上而得到亚克隆重组质粒pT7 ASFH5。用双脱氧末端终止法测定了该插入片段的核苷酸序列。在此基础上选择了一段含194bp的片段作为扩增模板,并人工合成了该片段两端含20个碱基的寡核苷酸作为引物,从而建立了诊断非洲猪瘟病毒的多聚酶链反应。与核酸杂交相比,该方法不但更为快速和简便,而且灵敏度提高了一千万倍左右.     

5个STR基因座的遗传多态性及其法医学应用

目的获得D11S4951、D11S4957、GATA193H05、D2S2951、D6S2421基因座的群体遗传学数据,并分析其在法医学中的应用价值。方法随机抽取成都地区汉族群体无血缘关系个体的静脉血,EDTA抗凝,用Chelex-100法提取DNA,应用PCR技术,扩增上述5个短串联重复序列基因座,聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分型。结果5个基因座在中国成都汉族人群中分别发现了7、10、8、6、8个等位基因,5个基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。各基因座的杂合度分别为0.743、0.772、0.833、0.650和0.800;非父排除概率分别为0.497、0.549、0.662、0.356和0.599;个人识别几率分别为0.863、0.912、0.947、0.829和0.931。结论5个基因座在中国汉族群体中具有法医学应用价值。     

微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量

目的 运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量.方法 选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释.使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性.结果 人重组质粒FAM （ND4）可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA.结论 微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验.     

联合应用多个DNA位点进行尸源鉴定

目的 研究联合应用多个ＤＮＡ位点在尸源鉴定方面的应用价值。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带的方法通过对无名尸休的有关检材与可疑双亲或子女进行亲权鉴定。结果 在８０例刑事案件尸源鉴定中,３８例无名尸体采用较新鲜肌肉,通过扩增ＶＮＴＲ、ＳＴＲ多个位点得以判明尸源;２９例采用腐败肌肉、６例采用骨骼和２例采用牙齿,通过扩增多个ＳＴＲ位点判明了尸源。仅有１例采用腐败肌肉、２     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法,根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物,建立了快速检测沙门菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果显示,所有沙门菌均扩增出526 bp的特异性条带,而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93 CFU,还可检出含3 CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液,而且稳定性良好,冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板,结果CTAB法效果最好,但操作烦琐,而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果,且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫SYBR Green real time PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测.结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40).表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查.