O78血清型禽致病性大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的研制及其对鸭的免疫保护作用

为有效控制禽大肠杆菌病的流行,制备了O78优势血清型禽致病性大肠杆菌(APEC)油乳剂灭活疫苗,并评价它对鸭的免疫保护效果。通过体内复壮、半数致死量测定、生物学特性分析筛选制备疫苗用菌株。然后制备油乳剂灭活疫苗,并测定其免疫保护率、最佳免疫剂量筛选、最佳免疫次数、免疫持续期及交叉保护性。结果显示,APCE94菌株制备的疫苗免疫保护性好、安全性高,可作为疫苗候选株。该疫苗仅以每只5×108 CFU的免疫剂量免疫1次即可提供90%的保护率,免疫雏鸭60d后仍可以提供很好的保护作用。本研究制备的O78血清型APEC油乳剂灭活疫苗可以有效保护鸭不感染O78血清型APEC,有助于鸭大肠杆菌病的防控治疗。     

猪丹毒杆菌表面抗原SpaA的原核表达纯化及免疫原性验证

本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱导表达、镍离子层析柱分离纯化、梯度透析获得高纯度重组SpaA蛋白。经免疫攻毒试验验证,重组SpaA蛋白能够有效保护小鼠和猪免于猪丹毒杆菌强毒攻击,其中小鼠的重组SpaA蛋白最小免疫剂量为每只2.0μg,100μg的重组SpaA蛋白能够保护猪免于猪丹毒杆菌强毒株感染。以重组SpaA蛋白作为组分与猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗共同免疫小鼠,结果显示该混合疫苗对于猪丹毒杆菌及猪多杀性巴氏杆菌均有良好的保护效果。本研究结果证实,重组SpaA蛋白是我国现行猪丹毒杆菌传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原,同时也具备良好的抗原相容性,其高纯度及低免疫剂量的特点也为其他组分提供了充足的剂量空间。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

人参皂甙Rg1对弓形虫P30融合蛋白免疫效果的影响

将120只ICR小鼠随机平均分为6组,除生理盐水对照组、P30融合蛋白免疫对照组和P30融合蛋白+弗氏佐剂免疫对照组外,其余3组分别在P30融合蛋白中按10、50、100μg/kg加入人参皂甙Rg1。将ICR小鼠皮下多点注射融合蛋白及融合蛋白与不同免疫佐剂的混合液,健康对照组用PBS代替;2周后以相同剂量和途径加强免疫一次。结果表明,人参皂甙各剂量组均能显著提高淋巴细胞的增殖水平和机体对融合蛋白的免疫应答水平;P30融合蛋白+弗氏佐剂免疫组的免疫保护效果最好;3个不同剂量人参皂甙组中以P30融合蛋白+50μg/kgRg1免疫组的保护效果最好。     

鸭疫里氏杆菌病灭活疫苗的研制

从河北省某肉鸭场的鸭疫里氏杆菌病发病鸭中分离出鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaa natipestifer ,RA)菌株。对该菌株采用液体、固体两种方法增菌培养后制成油乳剂灭活疫苗 ,以 0 .5mL/只剂量经皮下免疫 7日龄雏鸭 ,并在河北省某发病肉鸭场进行了田间试验 ,表明该疫苗免疫效果良好 ,保护率达 90 %以上     

副猪嗜血杆菌聚胺转运蛋白PotD重组亚单位疫苗的制备及其免疫保护效力的评价

为研究副猪嗜血杆菌Pot D蛋白的免疫保护效力,本研究以副猪嗜血杆菌SC1401菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增去除信号肽编码序列后的potD基因部分片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET-potD,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,超声破碎后SDS-PAGE分析目的蛋白表达形式。纯化后的蛋白以每只50 g的剂量免疫2周龄的BALB/c小鼠,同时设置SC1401全菌灭活疫苗组、生理盐水对照组及佐剂对照组,一免后第14天进行一次加强免疫,二免后第14天断尾采血进行抗体效价测定,并以5×LD50的SC1401野毒株攻毒,评价其免疫保护效力。结果显示,目的蛋白的分子质量为44.3 ku,主要以包含体形式存在;ELISA测定的Pot D蛋白的血清抗体效价(最高稀释度为1∶20 000,P/N2.1),显著高于SC1401全菌甲醛灭活苗(最高稀释度1∶10 000)、生理盐水对照组及佐剂对照组的血清抗体效价(P0.05)。攻毒后显示Pot D蛋白组的保护力达80%,与SC1401全菌灭活疫苗组持平,远高于生理盐水对照组及佐剂对照组。结果表明,Pot D重组蛋白能够很好的激发小鼠体内的免疫应答,提供较好的免疫保护力,可以作为副猪嗜血杆菌病重组亚单位疫苗的候选抗原蛋白。     

携带禽流感病毒DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌的免疫效力

将从重组质粒pVAX1-HA中扩增的HA基因和从pVAX1-HA-CpG中切出的HA-CpG基因分别克隆入pcDNA3.1(+)载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-CpG。将上述重组质粒分别转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验检测发现HA基因可在COS-7细胞中表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pcDNA3.1-HA)和SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)。将重组菌分别以5×109CFU口服免疫1日龄鸡2次,重组菌免疫组产生的小肠黏膜抗体效价与空载体组及油乳剂灭活疫苗组间存在显著差异。攻毒免疫保护结果表明,SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)免疫组与空载体组之间存在显著差异,而SL7207(pcDNA3.1-HA)免疫组则与空载体组间无显著差异,说明CpG可增强DNA疫苗的免疫效果。     

重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β和IL-2以及cMGF对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响

将128只10日龄SPF鸡随机分成8组,每只免疫1 PD_(50)的新城疫LaSota疫苗；同时Ⅰ～Ⅵ组鸡分别皮下注射不同剂量的重组鸡痘病毒rFPV-IL-1β、rFPV-IL-2或cMGF,而Ⅶ组和Ⅷ组鸡分别皮下注射鸡痘病毒wt-FPV和PBS作为阴性对照和空白对照。结果,重组鸡痘病毒表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫后第7d对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾中CD4~ T细胞在免疫后第7d和CD8~ T细胞在免疫后第14d的总体水平提高；免疫第21d新城疫F48E8强毒攻毒后,一定剂量的IL-1β和IL-2能提高免疫保护率,而cMGF却无此作用。结果表明,重组鸡痘病毒表达的IL-1β和IL-2在一定剂量下可增强新城疫LaSota疫苗的免疫效果。     

重组蛋白P60与LLO对单核细胞增多性李斯特菌灭活疫苗的免疫增强效果

为增强单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)灭活疫苗的免疫效果,对单增李斯特菌入侵相关蛋白(P60)基因进行了克隆、表达及纯化,分别与低剂量李斯特菌溶血素O(LLO)、单增李斯特菌灭活菌混合,以MontanideISA206为佐剂制成疫苗,皮下接种家兔,并设灭活疫苗免疫组和PBS对照组,定期检测3组家兔的血清抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化;二免后第21d每只家兔腹腔注射2×108CFU单增李斯特活菌攻毒,观察各组家兔的发病情况,每隔24h检测一次细菌在各组家兔体内的繁殖率。结果表明,添加P60和低剂量LLO重组蛋白的单增李斯特菌灭活疫苗免疫组家兔二免后抗体水平明显高于其他各组,且能诱导Th细胞向Th1型分化,抑制Th2型细胞的分化,调节抗原特异性免疫应答,能有效抵抗单增李斯特菌的感染,使细菌在家兔体内(外周血、脾)的几何增长率从64.69%降到24.06%,免疫效果明显优于灭活疫苗单独免疫组。证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果。     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

表达破伤风毒素C片段的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建表达破伤风毒素C片段基因的减毒鼠伤寒沙门菌,将编码破伤风毒素C片段的基因插入到asd 的组成型表达载体pYA3333,转化asd基因突变的E.coliX6212,获得重组质粒pYA3333-TetC,再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌,构建成表达破伤风毒素C片段基因的平衡致死的鼠伤寒沙门菌X4550(pYA3333-TetC)。免疫印迹试验证实,该重组菌表达的蛋白与预期的目的蛋白一致。重组菌X4550(pYA3333-TetC)的稳定性试验表明,在体外培养100代后,随机挑选的重组菌落全部都能生长,重组菌X4550(pYA3333-TetC)的生长曲线测定表明,X4550(pYA3333-TetC)和X4550(pYA3333)的生长状态基本一致。动物试验证明,该重组菌是安全的,破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用。     

疣状毛癣菌免疫原性的研究

本研究以疣状毛癣菌LTV菌株制成活菌湿苗、活菌冻干苗、灭活冻干苗及其代谢产物冻干菌,给犊牛进行肌肉注射免疫接种。活菌湿苗免疫4头牛,结果4/4保护,而湿苗对照组2/17保护;活菌冻干苗免疫7头牛,结果5/7保护;灭活冻干苗免疫7头牛,6/7保护;代谢产物冻干苗免疫5头,0/5保护;冻干苗对照组0/7保护。其结果证明,疣状毛癣茵(Trichophytonverrucosum)菌体对牛具有良好的免疫原性。     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。     

ELISA抗体水平评价口蹄疫灭活疫苗免疫效果的可行性分析

为了探讨免疫抗体评价口蹄疫灭活疫苗效果的可行性,分别用5批次的口蹄疫O型-亚洲1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株)、5批次的猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株+OS/99株)免疫动物,在攻毒的同时采血分离血清,用液相阻断ELISA测定抗体效价,以分析抗体效价与免疫保护的关系。统计学分析表明,二价灭活疫苗的O型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.01),相关系数为0.986;亚洲1型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.05),相关系数为0.997,猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间不呈正相关关系(P>0.05)。结果表明,应用抗体水平评价二价灭活疫苗的免疫效果是完全可行的,但用其评价猪O型灭活疫苗的免疫效果不具有可行性。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

阳离子脂质体包裹CpG对猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗免疫效应的影响

对 3组分别注射猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗 (简称三联疫苗 )、CpG +三联疫苗、阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗的小鼠细胞和体液免疫反应进行了比较分析。结果显示 ,阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗免疫小鼠脾细胞增殖反应明显增强 ,白细胞介素 2 (IL 2 )诱生活性和免疫细胞数量、血液IgG含量较仅注射三联疫苗的小鼠显著增加。说明阳离子脂质体包裹CpG能增强小鼠对三联疫苗的体液和细胞免疫应答反应 ,使疫苗的免疫原性增强