生物素标记核酸探针的应用概况

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和化学修饰核酸标记。但在这之前,用得较多的仍然是同位素标记的核酸探针。然而,由于放射性同位素的应用存在着不够安全方便、实验周期长、半衰期短、价格昂贵以及污染等缺点,使分子杂交技术的推广应用受到一定程度的局限。为此,各国研究工作者一直在探讨一种非放射性的核酸标记方法。近年出现的生物素标记的核酸探针技术就是这方面的一大突破,此种生物素化的脱氧尿嘧啶苷,     

核酸探针制备方法简介

随着分子生物学的飞速发展,利用核苷酸碱基配对原理建立的核酸杂交技术已广泛地应用于分子生物学、医学和兽医学的各个领域。核酸杂交技术的应用使疾病诊断由检测体内正常、异常成份变化的理化诊断方法和检测抗原-抗体反应的免疫学诊断方法发展到了基因诊断水平,从而使疾病的诊断更为准确、可靠。核酸杂交技术中,常用放射性同位素(~(32)P、~3H、~(35)S、~(14)C)或其它标记物(半抗原、酶、生物素)标记特异核苷酸片段来制备核酸探针。现将常用核酸探针制备的方法作如下简介。     

地高辛标记核酸探针及其应用近况

地高辛标记核酸探针及其应用近况罗满林，李光富，蔡宝祥，陈溥言（南京农业大学２１００９５）核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆，检测感染性疾病的致病因子和诊断遗传病。最早使用的放射性同位素标记核酸探针，具有敏感性高，特异性好和分辨力强的特点，故沿用至今。但...     

光生物素标记核酸探针检测水貂肠炎病毒的研究

水貂肠炎病毒(MEV)的检测,目前主要采用病毒分离和血清学方法。为了能直接从样品中检测病毒,我们于1988年秋冬,首次采用了光生物素标记核酸探针打点杂交的方法,结果证明这种方法效果良好,能特异地检出MEV,且灵敏度高,可检测出10pg水平的病毒DNA。     

国产与进口光生物素标记核酸探针的比较

我们用澳大利亚Bresatic公司生产的光生物素与国内两家(称甲所和乙所)研制的光生物素进行标记核酸探针作了比较试验。 探针标记 在3个硅化玻璃管中,分别加入5μ1λDNA(0.5μg/μl),于暗室中再分别加入5.5μl光生物素(国产与进口的浓度均为1mg/ml),放在冰浴上,200w汞灯照射25分钟。然后加入100μl 0.1mol TE(0.1mol Tris/HCl pH9.0,1mmol EDTA),用仲丁醇抽提两次,下层水相的体积约剩45μl,再加入22.5μl 7.5molNH_4AC,20.1μl冷无水乙醇,-20℃过夜,15000r/min离心,抽干,分别溶于27.5μl TE中。     

蓝舌病毒核酸末端标记方法的研究

应用[γ—~(23)P]ATP对蓝舌病毒核酸进行末端标记,结果表明3’末端标记制备的探针的放射比强度明显高于5’末端标记,而5’末端脱磷后再标记的结果同样较为理想。应用3’末端标记法或5’末端标记法皆能获得高放射比强度的核酸探针,完全满足于核酸试验。     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

光生物素标记DNA探针检测传染性喉气管炎病毒感染

用光生物素标记４．３ｋｂ的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＤＮＡ片段作为探针，检测５只人工接种ＩＬＴＶ的ＳＰＦ鸡在不同时期采集的喉拭子样品或血清，并检测采自自然发病鸡群的喉试子样品。结果表明，用核酸探针点杂交方法在人工感染鸡喉气管中检出ＩＬＴＶ的时间为接种后６～１０天；该法敏感、特异，对诊断ＩＬＴＶ感染有实用价值，特别适用于进出口检疫和ＳＰＦ鸡群的监测。     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

斑点印迹杂交技术测定牛疱疹病毒核酸序列

在斑点印迹、核酸杂交的基础上,R.H.Andin。等利用~(32)P标记、切口平移和质粒探针的方法建立了一种检测牛疱疹病毒1型阿根廷分离株的敏感和特异的方法。该探针包含病毒基因组左侧的克隆Bam H1限制性片段。该方法检测灵敏度为10pg病毒DNA。     

病毒病诊断新技术——聚合酶链反应

对病毒病的诊断主要依靠从病料中直接检出病毒或间接检出抗病毒抗体的方法,其包括:病毒的分离培养、电子显微镜观察和免疫学方法。近年来,人们应用核酸杂交技术直接检测病毒,即用标记核酸探针和靶病毒基因互补结合,通过检测标记物以达到诊断的目的,用该法检测时至少需要10~4～10~5个靶基因拷贝。由于有些病毒在数量很少的情况下可使宿主发病;有些病毒在感染早期病毒数量甚微,又无免疫     

光生物素标记六邻体蛋白基因探针检测减蛋综合征病毒的研究

根据基因文库中减蛋综合征病毒 (EDSV)AV12 7株的序列设计 1对引物 ,从四川本地分离的EDSVSG930 1株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到PUC1 8的多克隆位点中 ,经PCR、酶切分析、DNA杂交分析和序列测定证明 ,所扩增、克隆的基因包括了六邻体蛋白基因从起始密码子到终止密码子在内的完整序列。用光生物素对含六邻体蛋白基因的重组质粒标记后 ,采用斑点印迹法对 4株EDSV(标准株AV 12 7株和 3株四川分离株 )、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒的核酸进行检测 ,结果 ,该探针能检测出 4株EDSV ,但不能检出新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒。表明该六邻体蛋白基因探针具有特异性 ,检测的灵敏度高达 12pg。     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立及其初步应用

建立了检测CSFV的快速、敏感、特异的RT PCRELISA方法。在RT PCR过程中以地高辛标记的dUTP(DIG dUTP)标记PCR产物 ,用生物素标记的捕获探针在链亲和素包被微量板孔中杂交捕获PCR产物。该方法的敏感性较常规RT PCR方法高 10 0倍 ,可检测出 35 0 μL1∶10 0 (相当于 3.5mg)的兔脾组织悬液中的C株CSFV ,特异性强 ,避免了PCR过程中因污染导致的假阳性结果。通过对RT PCR和微量杂交系统的条件优化 ,该方法用于检测C株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品 ,效果良好     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒液相芯片检测方法的建立

为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

应用BA-ELISA法检测结核病牛血清抗体

我们从1988年开始,应用生物素亲和素系统BA-ELISA法,对295头份牛血清进行了检测,并同时与常规ELISA方法在敏感性、特异性、稳定性等进行了对比试验。均取得了满意结果。(一)材料和方法1.试剂:①结核杆菌纯蛋白衍生物(PPD)抗原,由北京中国生物药品检定所提供。本品批号:0083。②生物素化葡萄球菌A蛋白(B-SPA);③抗生物素标记辣根过氧化物酶(A-HRP);④兔抗牛IgG;⑤牛血清白蛋白;⑥小牛血清,以上由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供。⑦聚合“OT”,由湖北医学院微生物学教研室提供。     

核酸探针应用中存在的问题与解决对策

核酸探针作为诊断试剂已应用于人和家畜传染病、寄生虫病及遗传性疾病的临床检测和流行病学的调查。但由于存在特异性和敏感性等问题,限制了进一步在临床医学和临床兽医学上的推广。本文就当前的核酸探针做为诊断试剂在应用中存在的问题做一简述和分析,并介绍几种解决这些问题的新技术。     

放射性~(125)I、~(32)P标记丝虫感染蚴方法的建立及其应用

示踪原子在昆虫学,在细菌、病毒及其他生物学的应用屡见报道,但在奇生虫学方面研究颇少,尤其用于牛腹腔丝虫病的研究,则尚未见报道。我们试图用示踪原子的基本原理,建立放射性同位素标记丝虫感染蚴的方法,为观察其在实验动物体内的分布和径路,给研究丝虫病发病机理提供依据。我们首先用~(125)Ⅰ标记周期型马来丝虫感染蚴的方法获得成功,随后又用~(32)P在生物体内标记牛腹腔丝虫感染蚴获得成功。     

边缘无浆体病诊断方法的研究进展

综述了边缘无浆体病的常规病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学检测方法的国内外研究现状和发展水平,并探讨了核酸探针、PCR和反向线状印迹杂交技术在边缘无浆体病诊断中的应用及研究进展.