实时DNA定量技术的应用研究

通过应用TaqMan探针法和SYBR Green荧光染料法对常见的法医生物学检材进行DNA定量,对实时荧光定量PCR技术用于法庭科学样品定量检测的适用性进行研究。实验结果表明,该技术在DNA定量及抑制因素评估等方面具有重要的法医学应用价值。     

定量PCR技术在法医学中应用的研究

目的研究荧光定量PCR技术在法医学中的应用。方法应用Taqman技术对法医各种生物检材进行DNA定量。结果该定量PCR技术对各种法医生物检材进行了准确定量,并判断检材中是否存在抑制物,从而指导了后续STR的检验。结论定量PCR技术是法医DNA检验中一项不可缺少的辅助技术。     

实时RT-PCR检测大鼠死后管家基因mRNA的时序性降解

目的研究实时荧光定量RT—PCR方法检测死亡大鼠管家基因mRNA时序性降解的可行性,为死亡时间（Dostmortem interval,PMI）推断寻找新的研究手段。方法应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR技术．检测死后不同时间大鼠脑和脾中管家基因GAPDHmRNA及β—actinmRNA的水平,结果用循环阈值（简称Ct值）表示,分析死后经过时间与Ct值的线性关系,并建立死亡时间推断回归方程。结果GAPDH mRNA和β—actinmRNA的Ct值均与PMI之间存在显著的相关性。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT—PCR在定量分析mRNA降解的研究中是一个较理想的技术手段。选用管家基因作为PMI推断的研究对象,可在法医检案中消除其他基因因为个体差异带来的误差,更具实用性。Ct值作为动态监测机体死后不同时间点的客观指标．与死后不同时间点的线性关系良好,推断死后经过时间尤其是晚期死亡时间较为理想。     

Chelex-100提取生物检材DNA实时PCR定量研究

目的研究Chelex-100法提取的生物检材DNA用量与复合STR分型成功率的关系。方法113份各种生物检材采用Chelex-100法提取DNA，应用Quantifiler人类DNA定量试剂盒在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行实时PCR定量，同时用Identifiler复合扩增系统在ABI 3100遗传分析仪上对这些DNA样品进行STR分型。结果各种生物检材提取的DNA浓度分别为：37份滤纸、纱布血痕0．042～5．28ng／μl，16份口腔拭子1．15—4．21ng／μl，18份烟头0．016～1．46ng／μl，10份肋软骨0．531—14．40ng／μl，8份肌肉5．75—24．80ng／μl，7份指甲0．788—11．50ng／μl，17份精斑0．79～99．50ng／μl。在建立的8μl扩增体系中，根据上述结果，调整用于复合STR扩增的DNA模板量在0．5—3ng之间，大部分样品可获得完全的STR分型。结论Chelex-100法提取的检材DNA模板用量在0．5—3ng之间可得到有效STR扩增，浓度为0．5ng／μl以上的DNA样品，用小体积模板（1μl）比大体积（3μl）模板扩增效果好。     

国产磁珠结合自动化工作站批量提取生物检材DNA的应用

目的建立国产磁珠结合自动化工作站批量提取案件中生物检材DNA的方法。方法采用国产磁珠结合Bio-Robert Universal System自动化工作站对案件中常见的生物样本进行DNA提取,检测Identifiler系统16个STR基因座,在ABI3130XL遗传分析仪上进行STR分型。其中210份样品同时在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量。结果9100份10类生物检材应用国产磁珠结合自动化工作站,大部分可提取到足够的DNA进行STR检验。STR检验成功率最高的为口腔拭子、肌肉,达100%,接触细胞检材的成功率较低,为50.0%。结论国产磁珠结合自动化工作站可用于案件中常见的大部分生物样本的DNA提取。     

mRNA在体液斑鉴定研究中内参基因的选择与应用

利用mRNA分析技术鉴定生物检材中各种体液斑迹的组织属性来源是近年来法医物证学的一个重要进展。终点逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术是法医学实验室常用的mRNA检测技术,为保证实验结果的准确性,研究者通常选用组成性表达的管家基因作为内参,对不同样本提取RNA进行质控和标准化,以正确评估目标mRNA在各样本中的表达量。本文聚焦近年来使用mRNA分析技术进行体液斑迹组织属性来源鉴定的研究报道,对这些工作中内参基因的选择与应用效果进行综述。     

实时荧光定量PCR检测羊肉制品中鼠源性成分

目的建立基于实时荧光PCR技术的肉制品中鼠源性成分的快速检测方法。方法以羊和鼠的细胞色素b基因序列设计特异性引物和Taqman荧光探针,通过特异性、灵敏性及模拟混合肉样检测实验,建立羊肉制品中鼠源性成分实时荧光定量PCR检测方法。结果该检测方法具有良好的特异性和灵敏度,在50mg羊肉和鼠肉的混合样品检测中,鼠源性成分检测限可低至1%。结论所建立的鼠源性成分检测的实时荧光定量PCR方法,为肉制品质量控制提供了有效的技术手段,弥补了利用RTi-PCR检测肉制品中鼠源性成分的技术空白。     

微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量

目的 运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量.方法 选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释.使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性.结果 人重组质粒FAM （ND4）可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA.结论 微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验.     

荧光定量PCR技术验证Sinofiler试剂盒的适宜模板量

目的探讨Sinofiler试剂盒适合扩增的模板DNA用量。方法选取经Sinofiler试剂盒基因分型且图谱完整、扩增均衡性好的DNA样本,进行荧光定量PCR检测。结果实验结果表明,在12.5μL体系中,1.29～1.51ng的模板DNA能够获得理想的分型结果。结论应用荧光定量PCR技术检测不同试剂盒适合扩增的模板DNA用量是一种准确、有效的方法。     

荧光定量PCR技术研究线粒体DNA nt16519单核苷酸多态性

目的应用荧光定量PCR技术,建立mtDNA nt16519位点的PCR分型方法。方法应用Primer Express3．0软件,设计1对Taqman MGB探针和1埘扩增引物,在探针的5’端分别标记FAM和VIC报告荧光,应用7500荧光定量PCR和直接测序两种方法,分别榆测62份血样和18份毛发样本的mtDNA nt16519单核苷酸多态性,比较二种方法结果的一致性。结果62份血样和18份毛发样本均得到了可靠的mtDNA nt16519分型结果。结论建立的荧光定量PCR的分型方法操作简单、结果准确,适用于法医DNA检案。     

Qubit~快速荧光定量系统在法医学中的应用

目的研究Qubit定量系统在法医学中的应用。方法使用Quant-iTTM试剂盒检测法医DNA样本并得出样本浓度。结果Quant-iTTM试剂盒能检测并定量各种生物学检材DNA样本。结论Quant-iTTM试剂盒能够应用在法医学检验中。     

检材采集与保存方式对DNA提取效率的影响

目的 研究检材采集与保存方式对DNA提取效率的影响。方法 使用生物检材采集与保存套管棉签、尖头棉签和普通医用棉签采集血样,分别放置于生物检材采集与保存套管或纸质物证袋中保存1周。剪取全部血样于96孔板中,用磁珠法结合自动化工作站提取DNA,以ABI7500型荧光定量PCR仪定量。结果 生物检材采集与保存套管采集保存的血样所提取的DNA浓度平均为(2.54±0.63)ng/μL,而尖头棉签、普通医用棉签采集并分别用纸袋保存的血样提取的DNA浓度平均为(2.06±0.44)ng/μL和(0.93±0.59)ng/μL。结论 生物检材采集与保存套管较之于尖头棉签或普通医用棉签采集、纸袋保存方式,其获得的DNA浓度显著提高,DNA提取率高。     

Qubit?快速荧光定量系统在法医学中的应用

目的 研究Qubit 定量系统在法医学中的应用.方法 使用Quant-iTTM试剂盒检测法医DNA样本并得出样本浓度.结果 Quant-iTTM试剂盒能检测并定量各种生物学检材DNA样本.结论 Quant-iTTM试剂盒能够应用在法医学检验中.     

生物检材中的PCR抑制物及其处理技术

DNA分型技术在刑事案件的侦破中已得到广泛应用,但不同来源的各种生物检材往往含有PCR抑制物,其对扩增反应的影响不容忽视。因此,DNA样本扩增前预处理就显得尤为重要。本文主要就PCR抑制物种类及其对PCR的抑制机制、PCR抑制物应对技术等相关研究进展进行简要综述,旨在为相关研究和应用提供参考。     

应用自动化工作站提取常见生物样本DNA

目的建立使用自动化工作站提取法医案件生物样本DNA的方法。方法选用Biomek 3000自动化工作站,采用DNA IQTM系统及Chelex法对法医案件中常见生物样本进行DNA提取,荧光定量技术进行定量,PCR扩增16个STR基因座并与手工提取方法比较。结果与手工提取方法进行比较,选用自动化工作站结合使用DNAIQTM系统及Chelex法提取DNA可获得满意的STR检验结果。结论自动化工作站可用于法医案件中常见生物样本的DNA提取。     

线粒体DNA nt8584、nt8701单核苷酸多态性研究

目的建立一种快速、准确的线粒体DNA单核苷酸多态性位点检测方法。方法收集62份无关个体血液样本,应用荧光定量PCR技术研究线粒体DNA nt8584、nt8701位点在中国汉族人群中的多态性。结果 nt8584位点检测到10例nt8584A、52例nt8584G,nt8584A/G变异频率为16∶84;nt8701位点检测到27例nt8701A、35例nt8701G,nt8701A/G变异频率为44∶56。结论所建立的荧光定量PCR方法分型准确、耗时短,适用于法医DNA检验。     

Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究

目的研究脱落细胞检材DNA检验的简便有效的提取方法。方法对76份包括帽子、眼镜、牙刷、剃须刀、梳子、口香糖、羊水在内的7种脱落细胞检材采用Chelex-100法提取DNA,在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量,同时用Identifiler复合扩增系统扩增,在ABI3130遗传分析仪上进行STR分型。结果从帽子（头套）中获得的脱落细胞DNA平均含量为8.31ng,眼镜擦拭物上获得的脱落细胞DNA平均含量为6.20ng,牙刷上获得的脱落细胞DNA平均含量为49.40ng,剃须刀擦拭物上获得的脱落细胞DNA平均含量为6.92ng、梳子擦拭物上获得的的脱落细胞DNA平均含量为10.68ng,口香糖的脱落细胞DNA平均含量为16.30ng,羊水的脱落细胞DNA平均含量为320ng。以上76份检材性别及10个以上STR位点分型成功率为75.8%。结论从帽子、眼镜、牙刷、剃须刀、梳子、口香糖、羊水等检材提取的脱落细胞可用Chelex-100法提取DNA作STR分型。     

线粒体DNA的PCR-RFLP分型法医学应用研究

目的建立PCR RFLP技术检测mtDNA序列多态性的方法,调查武汉汉族人群mtDNAHVⅠ区段限制性片段长度多态性,并对PCR RFLP技术在毛干、指甲等生物检材的个体识别案件中的应用进行评估。方法应用nest PCR技术和RFLP技术建立检测mtDNAHVⅠ区段限制性片段长度多态性的方法,调查150例武汉汉族人群无关个体,同时对实际案件中的毛干、陈旧骨骼、水浸血痕等不同种类、不同保存时间和条件的生物检材进行检测。结果RsaⅠ酶切检出4种表型,频率分别为0.760、0.167、0.066和0.007,遗传差异度(GD值)为0.393,随机匹配概率(P值)为0.607。应用PCR RFLP对毛干、20年陈旧骨骼、水浸血痕进行了检测以及在个体识别及母子关系亲子鉴定案例中应用。结论用PCR RFLP法检测mtDNA序列多态性在法医物证检验中具有应用价值。     

微量口腔脱落细胞检材的DNA检验

目的寻求提高微量口腔脱落细胞检材的DNA检验成功率的简便有效的提取方法。方法对不同载体上的100份微量口腔脱落细胞检材采用小体积Chelex-100法提取DNA,在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量,同时用IdentifilerTM复合扩增系统扩增,在ABI3130遗传分析仪上进行STR分型。结果从25根饮料吸管上提取的DNA量在0.72～116.7.8ng,16个水杯杯缘提取的DNA量在2.15-142.5ng,31个饮料瓶(罐)口提取的DNA量在1～34.65ng,10根筷子上提取的DNA量在3.35～26.6ng,12个果核中提取的DNA量在0.294～21.4ng,6份吃剩的骨头中提取的DNA量在0.88～5.88ng。100份检材性别及9个以上STR位点分型成功率平均为59.38%。除了使用者的个人原因外,检材的提取送检方式、检材的质地、饮料的性质对提取的DNA量有显著影响,是否加蛋白酶K对提取的DNA量无显著影响。结论采用小体积Chelex-100法可对60%左右的微量口腔脱落细胞检材提取DNA进行STR分型。