细胞裂解法和磁珠法在法医DNA检验中的对比

目的 比较细胞裂解法和磁珠法在法医DNA检验中的效果,探讨两种方法在法医学检验中的运用。方法 使用细胞裂解法和磁珠法获取不同数量的THP-1细胞的基因组DNA并使用实时定量PCR检测DNA含量。使用细胞裂解法和磁珠法对不同稀释倍数的人血进行STR分型检测。结果 当THP-1细胞数量为100、400和800个时,使用细胞裂解法提取的DNA含量分别为(1.219±0.334)、(5.081±0.335)、(9.332±0.318) ng;使用磁珠法提取的DNA含量分别为(1.020±0.281)、(3.634±0.482)、(7.896±0.759) ng,在THP-1细胞数量为400和800个时,细胞裂解法提取的DNA含量高于磁珠法(P<0.05)。使用细胞裂解法和磁珠法检测不同稀释倍数人血的STR分型时灵敏度相近,在血样稀释100、300和500倍时均能获取完整的STR分型,血样稀释700倍时,均无法检出完整STR分型。使用细胞裂解法无法检出未稀释人血的STR分型。结论 细胞裂解法操作方便,能最大程度保留模板DNA,有望适用于微量血痕检验。     

陈旧性骨骼DNA提取方法的探索

目的探索陈旧性骨骼DNA的提取方法。方法收集4~15年陈旧骨骼样本,去除表面污染物,经脱钙、裂解提取各样本DNA,使用QIAquickPCR Purification试剂盒进行纯化,检测DNA纯度和浓度,应用Power PlexFusion荧光标记复合扩增系统进行扩增,AB-3500型遗传分析仪检测STR分型。结果 15例陈旧性骨骼经提取、纯化,提取的DNA模板浓度较高,在42.9~176.4ng/μL之间,A260/A280值较稳定,在1.06~1.40之间;所有样本均获得完整STR分型。结论该方法简便快速,提取效果好,能够适用于法医学实际检案。     

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。     

泥土中二氧化硅对硅珠法提取现场生物物证DNA的影响

目的 研究泥土中二氧化硅对硅珠法提取现场生物物证DNA的影响。方法 泥浆悬液和稀释血混合,制成混有灰尘、泥土的生物样本以模拟现场生物物证,分别用加热裂解和胍盐化学裂解的方式进行细胞裂解,硅珠法提取DNA后用Identifiler Plus试剂盒进行PCR扩增及毛细管电泳检测,并对电泳结果进行比较;用泥浆悬液代替硅珠提取稀释血DNA,反向验证泥土中二氧化硅对硅珠法提取现场生物物证DNA的影响。结果 混有泥浆悬液的4μL、20μL稀释血加热裂解,提取扩增后得到完整STR分型,平均峰高1 969.7±376.9 RFU、9 706.7±349.8 RFU;混有泥浆悬液的4μL稀释血胍盐化学裂解,提取扩增后无法获得完整STR分型;混有泥浆悬液的20μL稀释血胍盐化学裂解,提取扩增后得到完整STR分型,平均峰高1 899.8±801.3 RFU;泥浆悬液代替硅珠提取20μL稀释血得到完整STR分型。结论 泥土中的二氧化硅在胍盐存在条件下会与DNA结合,导致硅珠法提取现场生物物证DNA的回收效率降低。     

脱落毛发及毛干DNA的STR分型研究

目的探讨脱落毛发及毛干细胞核DNA提取、含量和STR分型问题。方法对脱落毛发或毛干进行DNA提取和定量,使用低扩增体系、增加循环次数和多次平行扩增等方法扩增DNA样本,采用叠加比较的方法分析STR分型。结果15cm脱落毛发样品DNA含量大于0．3ng的样品占52．8％,STR分型成功率为55．6％;15cm毛干样品DNA含量大于0．3ng的样品占30．6％,STR分型成功率为25％。结论采用增加循环次数、多次平行扩增等LCN—STR分型方法和Mini—STR试剂盒有助于脱落毛发及毛千的STR基因座分型获得。     

浓缩DNA法结合miniSTR分型技术检验微量DNA

目的优化低拷贝数DNA STR分型方法。方法对采用磁珠法或Chelex-100法提取DNA,Identi-filer试剂盒扩增,未获得分型结果的日常检案检材,采用物理浓缩法或过柱浓缩法浓缩DNA,采用miniFilerTM试剂盒再次扩增分型。结果 127例检材中,47例磁珠法提取DNA未获得分型的样品,分型成功率为36%;80例Chelex-100法提取DNA未获分型的样品,分型成功率为30%。结论采用浓缩法和miniFilerTM试剂盒,可以提高日常检案中低拷贝数检材的STR检验分型成功率。     

运用酚-氯仿法结合磁珠法提取蝇蛆体内人类DNA

目的建立运用酚-氯仿法结合磁珠法从蝇蛆嗉囊内提取人类DNA的方法,从而提高STR分型检验的灵敏度。方法采用酚-氯仿法对蝇蛆嗉囊内容物中的人类DNA进行提取,提取产物经磁珠法纯化浓缩后用QuantifilerTM人类DNA定量试剂盒在7500型实时荧光定量PCR仪上进行PCR定量,再用AmpF■STR IndentifilerTM试剂盒在3130XL-Avant遗传分析仪上对这些DNA样本进行STR分型。结果本研究建立的方法可增加模板DNA浓度约为单独使用酚-氯仿法的2倍。用此方法提取到的DNA浓度[（0.218±0.041）ng/μL]可获得全部16个STR分型结果。结论酚-氯仿法结合磁珠法可以有效地提高提取到的人类DNA样本STR分型检验的灵敏度,对于从事法医昆虫学方面研究的工作者有较好的实用价值。     

人体组织在非缓冲福尔马林固定剂中的STR检测时限

目的评估经非缓冲福尔马林固定不同时间后的人体组织STR分型有效性,了解各种人体组织在非缓冲福尔马林固定剂中可获得完全STR分型位点的时限。方法市售40%福尔马林溶液经1∶9稀释后在室温(15～20℃)下固定人体组织,不同时间后取样。以QIAamp DNA法和IQTMDNA System法提取DNA,用quantifiler humanTaqman探针法进行DNA定量,用常规16 STR位点的AmpFSTR identifiler kit和短小片段9 STR位点的AmpFSTR Min-iFiler kit进行PCR扩增,在3100遗传分析仪进行扩增DNA片段长度检测,用GeneMapper ID v3.2对STR位点检出率进行分析。结果福尔马林固定时间、组织类型以及DNA提取方法、PCR的DNA模板终浓度均影响非缓冲福尔马林固定后人体组织STR分型效能。DNA提取用QIAgen法为优,DNA模板终浓度的最佳范围在1～3ng/μL。各类型组织在非缓冲福尔马林固定剂中的降解速率有差异,肺组织的降解速率最慢,肝、肠组织最快。固定时间在4d内的组织可以获得常规STR的完整位点数;固定时间在15d内的组织可以获得miniSTR的完整位点数。结论非缓冲福尔马林固定人体组织时间是影响STR分型的最主要因素,其次组织类型、提取方法、DNA模板浓度及STR基因座的选择也是此类降解样品成功检测的关键因素。     

改良IPEP法用于痕量DNA检测的实验研究

目的探讨改良扩增前引物延伸(IPEP)法对痕量DNA样本STR检测分型的效果。方法用改良IPEP法对痕量样品DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR~ Indentifiler~试剂盒作基因型检测。结果该方法可增加模板DNA约200~1100倍。基因组DNA不低于0.025ng时,可获得15个STR基因座和Amelogenin性别基因座的分型结果。基因组DNA0.01~0.025ng时,可获得9个以上基因座的分型结果。结论改良IPEP法可有效提高痕量DNA样本STR分型检验的灵敏度,有较好的实用价值。     

汗潜指印的STR分型检测

目的探索汗潜指印的荧光STR复合扩增检测的方法。方法采用Chelex-100和Microco-100浓缩柱,提取汗潜指印中DNA,STR复合扩增荧光电泳检测。结果 105例汗潜指纹STR分型可明确判读5个以上基因座的占30.3％,个体之间的差异、捺印指印时用力大小以及指印遗留在客体上时间的长短均影响检测成功率。结论该汗潜指印的DNA提取方法步骤简单,方法较为稳定,使单枚汗潜指印可望获得DNA分型。     

多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增(MDA)技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Profiler PlusTM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加104～106倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果;低于0.1ng的样品DNA经MDA扩增后,基因座检出数增加,但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0.1ng时,MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

激光捕获显微分离技术在DNA检验中的应用研究

目的建立一套显微细胞捕获技术用于法医学生物检材DNA检验方法。方法使用VeritasTM LCM激光捕获仪,采用紫外加红外的捕获方式,对框架覆膜玻片上经苏木素染色口腔上皮细胞进行捕获,采用改良硅珠法提取细胞DNA,使用Identifiler TM试剂盒在5μL体系中进行PCR扩增。结果成功获得20个口腔上皮细胞的13个以上完整STR基因座分型谱带。结论本研究建立的方法适合法医学生物检材制成的染色涂片上细胞的DNA检验。     

多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增（MDA）技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增（WGA）．扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Prrfiler Plus^TM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加10^4～10^6倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果；低于0．1ng的样品DNA经MDA扩增后，基因座检出数增加。但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0．1ng时，MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

自动化工作站与Chelex-100法对血样本检验效果比较

目的比较自动化工作站与Chelex-100法对不同浓度血液样本的检验效果。方法取新鲜血液,按倍量稀释法制成2~1 024倍10种不同浓度的血样本,分别采用自动化工作站和Chelex-100法提取模板DNA,应用Identifiler Plus试剂盒进行扩增及毛细管电泳检测,并对电泳结果进行比较。结果稀释2~32倍的血样本,采用两种方法的检验成功率均可达到100%;稀释64倍的样本,Chelex-100法成功率为41.3%、完整分型数为78.3%,自动化工作站成功率为13.0%、完整分型数为43.5%,两者比较,差异均有统计学意义(P0.01);稀释128倍的样本,成功率在Chelex-100法(8.7%)和自动化工作站(2.4%)之间比较,其差异无统计学意义(P0.05);稀释256倍以上,两种方法均无法获得分型结果。结论自动化工作站适用于一定浓度血样的检验,而对于微量血样,Chelex-100法的效果可能更优。     

镜下单片状头屑DNA提取分型法与EZ-tape法的比较

目的改进常规头屑类样本的EZ-tape提取分型方法,借助显微镜采集单片状头屑,提高样本利用率、降低漏检率,并减少混合分型结果比例。方法采用EZ-tape脱落细胞粘取器和透明胶带粘取2名志愿者轮流佩戴的帽子内侧,EZ-tape法遵循传统方法直接提取DNA,镜下单片状头屑DNA提取分型法(简称"单片头屑分析法")则借助显微镜分拣出透明胶带中的单片状头屑。两种方法均分别进行持续振荡和静置消化。所有样本均采用Chelex-100法提取DNA,扩增及电泳后获得STR分型。比较EZ-tape法及单片头屑分析法所获的STR分型结果。结果 EZ-tape法所获分型中11份(45.8%)样本发生漏检,仅获得单一来源的分型结果,10份(41.7%)样本为混合分型结果,其中6份样本有等位基因插入或丢失。单片头屑分析法有12份样本获得了与志愿者一致的单一来源分型结果,仅2份样本获得混合分型结果。振荡处理的分型准确数高于静置消化(P0.05)。结论 DNA提取过程中进行振荡有利于DNA的释放。单片头屑分析法获得单一来源STR分型成功率较高,样本漏检率低,可作为法医临案工作中头屑类特殊检材的特定样本采集方式。     

粪便DNA提取及检验

目的　研究人类粪便DNA的提取和检验方法。方法　 8人份粪便样本 ,磁珠法提取DNA后 ,进行STR复合扩增和mtDNAHVI区测序分析。结果　用 2种方法提取的粪便DNA ,STR复合扩增检验均未获成功 ;方法1提取的粪便DNA有 6个样本、方法 2有 7个样本获得了清晰可读的mtDNAHVI区序列 ,并与唾液对照样本DNA的序列完全一致。结论　用本文建立的方法提取粪便DNA ,不适于STR分析 ,可通过mtDNA测序分析进行检验。     

IDentifier DNA分型盒（炎黄34）的法医学验证及应用评估

目的 测试IDentifier DNA分型盒(炎黄34)的技术性能指标,评估其法医学应用价值。方法 根据《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》(GB/T 37226—2018),从种属特异性、分型准确性、灵敏度、适应性、耐受性、一致性、均衡性、反应条件验证、混合样本、稳定性、批间差11个方面对IDentifier DNA分型盒(炎黄34)进行测试。比较IDentifier DNA分型盒(炎黄34)与Power Plex^?Fusion 6C系统、Versa Plex^?27PY系统、Veri Filer^TM Plus PCR扩增试剂盒的系统效能。使用IDentifier DNA分型盒(炎黄34)检测日常案件中的拭子类生物检材,观察其STR检验结果 。结果 IDentifier DNA分型盒(炎黄34)具有良好的种属特异性、分型准确性、适应性、耐受性和均衡性,灵敏度可达0.062 5 ng,能检测案件中不同类型的检材、降解检材及混有抑制剂的检材,对混合比例为4∶1以内的样本均能获得完整分型。该试剂盒的系统效...     

单细胞检验技术用于混合上皮细胞的分离和检验

目的建立单细胞显微捕获联合低体积扩增技术,用于混合上皮细胞检材分离检验。方法取5名男性口腔上皮细胞拭子浸泡液30μL,分别滴加到5份含同一女性皮肤表皮细胞拭子上,制成5份混合上皮细胞样本为实验组,同时制备同样的5份样本为对照组。实验组样本采用显微捕获单个口腔上皮细胞,并使用低体积扩增技术进行扩增;对照组用M48纯化试剂盒提取DNA,Identifiler试剂盒复合扩增,扩增体系为10μL。所有产物均用ABI 3130遗传分析仪进行STR分型。结果 5份实验组样本均得到男性STR分型结果,5份对照组样本则均仅得到混合分型结果。将该方法应用于1例强奸杀人案例检验,取得了满意效果。结论单细胞显微捕获联合低体积扩增技术可用于混合上皮细胞样本的分离检验。     

单核苷酸多态性与DNA芯片技术在法医学中的应用

８０年代中期,Jeffreys建立的DNA指纹技术是法医学DNA分型的里程碑。针对人类基因组小卫星VNTR位点靶序列作RFLP分析,获得高度个体特异性DNA指纹图,使法医学第一次能够作出认定同一性,认定亲生关系的鉴定结论。此为第一代法医DNA分型技术。８０年代后期,Mullis建立PCR技术,以基因组内STR位点多态性位点为靶序列作PCR扩增,利用电泳分离,分析STR位点多态性。PCR－STR分型结合了PCR高效扩增和STR位点高度多态性的特点,成功地解决了检测灵敏度问题,采用复合扩增多STR位点的办法,鉴别能力达到或接近DNA指纹水平…     

联苯胺试验对血痕DNA检验的影响

目的探讨联苯胺试验及相关试剂对血痕DNA检验的影响。方法制作含1μL静脉血的滤纸血痕970份,其中10份为对照样本,960份经联苯胺试验及相关试剂分别处理后,采用Chelex-100法和硅珠法提取DNA,Amp F詛STR~(TM)Identifiler~(TM)Plus PCR扩增试剂盒进行复合扩增,对比各组STR分型结果。结果联苯胺试验后立即提取DNA,硅珠法的STR基因座检出数为(3.80±1.34)个,而Chelex-100法均未获得STR分型结果;联苯胺试验后干燥处理,硅珠法有13例(21.7%)获得全部STR基因座分型结果,且STR基因座检出数[(12.90±1.49)个]远高于Chelex-100法[(4.70±1.96)个](P0.05);加入冰醋酸后立即提取DNA,硅珠法的STR基因座检出数为(9.40±2.09)个,而Chelex-100法均未获得STR分型结果;只加冰醋酸后干燥处理以及只加四甲基联苯胺乙醇饱和溶液或3%过氧化氢溶液,两种方法均获得完整15个STR基因座分型结果。结论联苯胺试验对血痕的后续DNA检验有很大的影响,Chelex-100法不适合联苯胺试验后血痕的DNA检验,联苯胺试验后干燥处理及采用硅珠纯化的方法可有效提升联苯胺试验后血痕的STR基因座检出数。