DNase-Ⅰ纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA

目的研究脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA的方法在法医学中的应用。方法收集79份性犯罪案件混合斑检材,分别用DNase-I纯化结合碱性裂解法和差异裂解法提取精子DNA,采用STR荧光标记复合扩增体系进行16个STR基因座分型,并比较检验结果。结果应用DNase-I纯化结合碱性裂解法提取精子DNA,64例检材分型成功;应用差异裂解法提取精子DNA,57例检材分型成功;两种方法比较结果存在显著性差异(P=0.039),DNase-1纯化结合碱性裂解法提取精子DNA的STR分型成功率更高,成本低廉。结论DNase-I纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA可提高检验成功率,操作简便,快速,易于自动化,适于法医学个体识别鉴定。     

DNase-I纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA

目的研究脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA的方法在法医学中的应用。方法收集79份性犯罪案件混合斑检材,分别用DNase-I纯化结合碱性裂解法和差异裂解法提取精子DNA,采用STR荧光标记复合扩增体系进行16个STR基因座分型,并比较检验结果。结果应用DNase-I纯化结合碱性裂解法提取精子DNA,64例检材分型成功;应用差异裂解法提取精子DNA,57例检材分型成功;两种方法比较结果存在显著性差异(P=0.039),DNase-1纯化结合碱性裂解法提取精子DNA的STR分型成功率更高,成本低廉。结论DNase-I纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA可提高检验成功率,操作简便,快速,易于自动化,适于法医学个体识别鉴定。     

3种分离提取混合斑精子DNA的方法比较

性犯罪案件中最常见的生物学检材为精液与阴道分泌液混合斑,其精子DNA的提取通常情况下采用常规的差异裂解细胞法结合酚、氯仿抽提[1],但由于检材条件各不相同,有些混合斑中精子细胞极少,核酸得率和纯度较低,有检测失败的可能或致使精子STR分型困难[2]。文献曾报道过多种改良方法[3,4],但其成功与否很大程度上受到检验人员的经验、水平等主观因素以及检材的具体条件影响。本文作者应用差异裂解法、Phase lock GelTM法[5]和D ifferexTM法[6]对三组不同条件的混合斑样品分离提取精子DNA,使用Powerplex16TM试剂盒分型,对3种方法进行比…     

Maxwell 16裂解纯化法提取陈旧精子DNA的应用

目的利用Maxwell 16裂解纯化法从保存8年以上陈旧精斑检材中获取精子DNA。方法 8份陈旧精斑检材采用Maxwell 16裂解纯化法提取精子DNA,并采用Powerplex○R21试剂盒进行复合扩增,产物用AB3130型遗传分析仪检测,结果与常规方法进行对比。结果成功获得8份陈旧精斑检材精子STR分型。结论差异裂解配合Maxwell 16裂解在陈旧精斑检材精子DNA检验中效果明显。     

精子富集柱分离技术的研究

目的在传统差异裂解法基础上,研究建立新的混合斑检材中精子分离技术。方法根据精细胞的结构特点,研制精子富集柱。取混合斑检材经第一步消化后的混合液,加入精子富集柱中离心,使DNA等小分子物质透过,而精细胞被特异性黏附和拦截在富集层中。采用本文技术和常规裂解方法对12份混合斑检材中精子进行分离,分离后精子DNA采用Identifiler试剂盒进行PCR扩增和电泳检测。结果混合斑检材经精子富集柱分离后均获得单一男性精子的STR分型结果,而12份检材用常规裂解方法分离,其中有6份检材女性成分去除不完全或未能检出精子STR基因型。结论本研究建立的精子富集柱分离技术适用于常见混合斑检材中精子的分离,特别适合对含有大量女性混合物而精子量较少检材的分离提取。     

尼龙膜套管分离技术对混合斑中精子细胞DNA的提取

目的建立新型的混合斑中精子细胞分离的方法,并评价其应用价值。方法收集性侵案件中的40份混合斑检材,分别采用常规差异裂解法和尼龙膜套管分离技术进行精子细胞分离,使用硅膜试剂盒(Forensic DNA Extraction Kit for Soft Tissues)提取精子细胞DNA,Amp FlSTR~ Identifiler~ Plus PCR扩增试剂盒进行PCR扩增,3500x L基因分析仪进行电泳检测,并对两种分离方法的结果进行对比。结果 40份混合斑检材中,采用尼龙膜套管分离技术的检材仅3份有女性成分微弱残留,余均获得了完整的单一男性分型。而采用常规差异裂解法分离的检材中,有25份完全未检出男性精子细胞STR分型,15份检出男性精子细胞STR分型(7份不完整男性精子细胞STR分型,6份有女性成分残留,2份单一的男性精子细胞STR分型)。结论本研究建立的尼龙膜套管分离技术适用于混合斑中精子细胞的分离,特别是对含有大量女性细胞而精子细胞较少的检材提取效果明显,整个提取实验成本低廉、快速简便。     

差异提取试剂盒在混合斑DNA提取中的应用

目的评估差异提取试剂盒对混合斑样本中的精子和上皮细胞DNA分离提取的有效性。方法采用差异提取试剂盒,选择性裂解精细胞和上皮细胞,结合磁珠法分别对人为控制条件下制备的模拟混合样本和案件中的混合斑检材进行精细胞DNA和上皮细胞DNA的分离提取。对所提取的DNA进行定量分析和STR分型。结果该试剂盒能从精子和上皮细胞不同比例的混合斑中提取出高纯度的精细胞和上皮细胞DNA。结论该差异提取试剂盒适用于性侵害案件中混合斑检材的DNA提取。     

混合斑中精子细胞分离实验条件探讨

在性犯罪案DNA检验中,含有精液和女性成分的混合斑检材,一般先采用两步裂解法分离精子与女性成分,然后再分别进行DNA检验。但在实践中发现,含有大量女性成分而精子较少的混合斑进行首次裂解需较长时间或需进行多次裂解,因不能得到足够的精子量使分型失败。为此本文通过调整试验条件,以期提高实验成功率。     

改良硅珠法提取DNA的灵敏性及稳定性评价初探

目的通过比较对改良硅珠法提取DNA的灵敏性和稳定性进行评价。方法样本模板使用9947A(0.1ng/μL),以30pg为等差,配置10~700pg共24种不同浓度的DNA模板,分别采用常规硅珠法与改良硅珠法提取并纯化模板DNA,在Gene Amp PCR System 9700上进行PCR扩增,ABI 3500XL型荧光分析仪进行电泳检测。结果与9947A标准品阳性对照比较,采用常规硅珠法检验,24份样本均未获得成功分型;采用改良硅珠法检验,当模板量达到550pg时,即可得到所有基因座的成功分型;模板量达到580pg及以上时,16个基因座图谱峰值均可超过200RFU,分型稳定准确。结论改良硅珠法提取DNA易于操作,稳定性较好,灵敏度优于常规硅珠法,可在法医微量物证DNA检验中应用。     

用Chelex100法及有机溶剂提取法联合提取DNA扩增STR基因座的比较研究

为了比较不同方法提取DNA扩增STR基因座的成功率 ,本文用Chelex10 0法及Chelex10 0法联合有机溶剂提取法分别提取性犯罪案件 6份血斑及 6份混合斑中精子DNA ,并用PE公司ProfilerPlus系统复合扩增 ,ABI 310型基因分型仪检测。结果表明 ,常规采用Chelex10 0法提取血斑及精斑等生物检材DNA作STR基因座检验失败或所检测的位点较少时 ,应对Chelex10 0法提取的DNA上清液再用有机溶剂提取法提取 ,可极大提高DNA检验成功率。采用本文建立的Chelex10 0法联合有机溶剂提取法 ,提高了PCR扩增阳性率 ,对实际检案很有帮助 ;在PCR扩增前应常规进行DNA定量检验 ,否则对于重要检材应进行梯度扩增。     

显微操作法提取混合斑中精子细胞方法的探讨

目的尝试建立一种提取混合斑中精子细胞的检测方法。方法在人为控制条件下,制备精液—阴道液混合斑,分别使用显微操作法与差异裂解法分离精子细胞,提取DNA,进行STR基因型检测。结果采用显微操作法检测成功率11/12,差异裂解法成功率1/12,两者有显著性差异。结论显微操作法可有效获取精子细胞,排除女性物质和其它杂质的干扰,STR分型成功率优于差异裂解法。     

Alternative direct-to-amplification cell lysis techniques for forensically relevant non-sperm cells

While efforts have been made to reduce the pervasive backlog of sexual assault evidence collection kits, the actual laboratory process remains very time-consuming due to the requirement of a differential lysis step before DNA purification, as well as intricate mixture analysis towards the end of the DNA workflow. Recently, an alternative, direct-to-amplification sperm lysis method (using 1 M NaOH) was identified. However, a direct cell lysis method for non-sperm cells has not been identified yet. Thus, the primary objective of this work was to find an alternative method that is quick, inexpensive, and does not require multiple purification steps for the lysis of non-sperm cells in sexual assault samples. In this study, vaginal swab samples were lysed with the control method, prepGEM™, as well as six alternative reagents: alkaline buffer with 25–200 mM NaOH, high-salt stain extraction buffer, modified radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer, mammalian protein extraction reagent (M-PER™), digitonin buffer, and urea/thiourea buffer. Quantification using Quantifiler® Trio of vaginal and semen lysates revealed that the alkaline (25 mM NaOH) and M-PER™ methods were efficient for the lysis of vaginal epithelial cells without substantial sperm cell lysis. Following quantification, analysis of STR profiles from vaginal lysates revealed that the M-PER™ method showed promising results across all metrics examined, including the percentage of detected STR alleles, mean peak heights, peak height ratio, and interlocus balance. Thus, this method was recommended as an alternative to the traditional differential lysis method for non-sperm cells given its ability to produce amplification-ready lysates without any DNA purification step.     

激光捕获显微切割技术用于分离混合斑中精子细胞

目的 评估激光捕获显微切割(laser capture microdissection.LCM)技术在分离混合斑中少量精子细胞的应用价值.方法 配制不同比例的精液-阴道上皮细胞混合液.分别用差异裂解法和LCM法分离精子细胞,用磁珠法提取精子细胞DNA,并用IdentifilerTM试剂盒进行STR基因型检测.结果 LC...     

3种DNA提取法在污染严重混合斑分型中的应用比较

目的比较Chelex-100法、酚/氯仿法和二氧化硅膜法3种DNA提取法在污染严重混合斑分型中的应用效果。方法从日常案例中收集污染严重的混合斑25份,差异消化法分离精子后同时用Chelex-100法、酚/氯仿法和二氧化硅膜技术3种方法提取DNA,采用PCR-STR技术对D19S253、FGA和CSF1PO 3个基因座进行分型,Gel-Pro软件处理电泳图谱,SPSS软件分析比较不同方法之间的差异。结果采用Chelex-100法提取DNA,25份检材分型结果均未成功;采用酚/氯仿法,25份检材中10份分型成功,3份检材FGA和CSF1PO基因座可分型,4份检材CSF1PO基因座可分型;采二氧化硅膜纯化法,25份检材均成功分型;酚/氯仿法和二氧化硅膜法两种方法比较,结果存在显著性差异(P<0.05)。结论二氧化硅膜纯化技术可以有效去除PCR抑制物,提取的DNA扩增效果明显优于Chelex-100法和酚/氯仿法,具有较高的应用价值。     

磁珠法对混合斑中精子DNA批量自动提取的应用研究

目的 建立混合斑中精子DNA批量自动提取的方法.方法 对56例混合斑经第一步消化后的精子沉淀用DNA IQ试剂盒和Biomek（R）2000全自动核酸工作站自动提取纯化,3130xl型遗传分析仪分析结果.结果 56例混合斑检材均得到较好的STR分型结果.结论 DNA IQ试剂盒和Biomek（R）2000全自动核酸工作站批量自动提取纯化混合斑的方法快速简便,可应用于法庭科学实践.     

应用磁珠法提取陈旧骨骼DNA

目的探讨采用磁珠法提取陈旧骨骼DNA的可行性。方法取经土埋或室外暴露下存放1~5年不等的10根长骨,经水洗、刮净,钻取骨密质骨粉3g,应用EQ1000磁珠试剂盒提取DNA,经复合扩增,ABI 3130XL基因分析仪电泳分离,进行STR分型检测。结果 10根长骨均获得完整的STR分型,电泳图谱基线干净,除个别大片段基因座外,等位基因荧光信号分布均衡性较好。结论采用磁珠法提取陈旧骨骼的DNA,能满足分型要求,可在实际检案中选用。     

STR基因座三带型等位基因的统计学分析

目的探讨STR基因座三带型等位基因的统计学方法。方法对8846份无关个体的静脉血或血痕样本利用磁珠法提取血液DNA，通过复合荧光扩增和毛细管电泳得到STR基因型，采用GeneMapperIDv3．2软件分析STR基因型，并通过直接计数法检测三带型基因型频率，公式计算三带型等位基因频率，并推导三带型统计学分析在亲缘鉴定及个体识别中的公式。结果8846份样本中，共检出4例三带型等位基因和3种三带型基因型。且发现等位基因基因频率的乘积与实际发生率差异具有统计学意义，并成功推导出三带型在亲缘鉴定及个体识别中的公式。结论三带型等位基因某两个等住基因作为整体在群体中遗传的频率可用这两个等位基因频率的乘积进行估算。     

Laser microdissection separation of pure spermatozoa from epithelial cells for short tandem repeat analysis

Short tandem repeat (STR) analysis is a valuable tool in identifying the source of biological stains, particularly from the investigation of sexual assault crimes. Difficulties in analysis arise primarily in the interpretation of mixed genotypes when cell separation of the sexual assailant's sperm from the victim's cells is incomplete. The forensic community continues to seek improvements in cell separation methods from mixtures for DNA typing. The feasibility of applying laser microdissection (LMD) technology to precisely separate sexual assault cell mixtures by visual inspection coupled with laser dissection was assessed through three experiments. First, various histological stains were evaluated for use with LMD and DNA analysis. Second, different DNA isolation methods were evaluated on LMD-collected cells. Finally, STR analysis was performed on LMD-separated sperm cells from mixtures of semen and female buccal epithelial cells. The results indicated (a) hematoxylin/eosin staining performed best in its ability to differentiate sperm and epithelial cells while exhibiting the least negative effect on further downstream analysis; (b) both QIAamp and Lyse-N-Go methods were useful for recovery of DNA from LMD-collected sperm cells; and (c) LMD separation provided clear STR profiles of the male donor with the absence of any additional alleles from the female donor. This report describes an efficient, low-manipulation LMD method for the efficient separation of spermatozoa from two-donor sperm/epithelial cell mixtures.