溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系

目的构建溺死相关浮游生物基因座的复合扩增体系,验证体系特异性并评估其在法医溺死诊断中的应用价值。方法针对溺死相关浮游生物同源基因序列,设计特异性引物,并用FAM、HEX、TAMRA、ROX、SIZ荧光染料分组标记,构建复合扩增体系;进行体系特异性验证;以16例实验猪样本评估体系检验效能;复合扩增体系、硅藻形态学MD-VF-Auto SEM检测法及硅藻rbc L基因PCR-CE检测法分别检测28例案件样本,比较分析应用效果。结果该复合扩增体系共包含14个基因座,可特异性扩增35种浮游藻类和3种浮游细菌,人、3种人体共生菌及8种浮游细菌均为阴性。以该体系检测溺死实验猪,阳性率为90%,非溺死实验猪均未检出;检测溺死案件样本,阳性率为96%,非溺死案件均未检出。复合扩增体系与MD-VF-Auto SEM法检测案件尸体肺、肝和肾的阳性率均不具有统计学差异(P>0.05),但其与硅藻rbcL基因PCR-CE法检测案件肝和肾的阳性率均具有统计学差异(P<0.05)。结论本文针对多种溺死相关浮游生物14个基因建立的复合扩增体系,具备多种靶物种的特异性遗传标记,且所需检材量小,提高了检测效能,在法医溺死鉴定中具有良好的应用前景。     

绿藻ChlB基因和蓝藻NIES基因在溺死相关浮游生物检测中的应用

目的利用绿藻ChlB基因和蓝藻NIES基因,建立聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法针对GenBank中绿藻ChlB基因和蓝藻NIES基因的保守序列,设计特异性引物ChlB和引物NIES,以此构建PCR-CE检测方法。扩增50种标准样本DNA。阳性标准样本梯度浓度检测,确定灵敏度。检测25例尸体肺组织样本(溺死20例,自然死亡5例),同时比较微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法(microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM)的同步检测结果。结果引物ChlB和引物NIES最低检测DNA含量分别为0.161、0.109ng,可分别特异性扩增水体广泛存在的绿藻(蛋白核小球藻)和蓝藻[铜绿微囊藻(产毒及不产毒)],产物片段分别为156、182bp,非溺死器官组织检测结果均为阴性。结论构建的方法灵敏度高、特异性好,能很好地应用于溺死相关浮游生物检测,与MD-VF-Auto SEM法联用,可以增大溺死相关浮游生物的检测范围,提高溺死诊断的证据力。     

实时荧光定量PCR检测硅藻UPA基因在溺死诊断中的研究

目的建立硅藻UPA条形码基因的实时荧光定量PCR检测方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法对Gene Bank中登录的硅藻UPA基因序列进行比对获得同源序列,据其设计硅藻门通用引物。对2种人体常见共生菌(大肠杆菌、双歧杆菌)、3种浮游细菌、15种浮游藻类、32具尸体(其中生前溺水死亡28例,死后抛尸1例,陆地死亡3例)的组织样本(肺、肝、肾)及尸体发现地水样提取DNA,采用设计的引物进行特异性、灵敏度、重复性试验,分析检材中硅藻检出情况,统计硅藻阳性率,以上述组织样本的微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法检测结果对建立的q PCR检测方法进行比较评估,比较该方法与PCR-毛细管电泳检测法的灵敏度。结果引物UPA99仅对硅藻标准株(针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻)DNA具有扩增,扩增产物熔解曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为(87±1)℃。以p MD18-T重组质粒为标准品,检测区间为1.56×10~2-1.56×10^-5ng/μL,建立实时q PCR方法的灵敏度为1.56×10^-5ng/μL,而PCR-CE方法的灵敏度为1.56×10-3ng/μL。批间及批内变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。对于生前溺水尸体肺、肝、肾的检出率依次为89.3%,71.4%,64.3%。结论基于硅藻UPA基因设计通用引物,建立的q PCR硅藻检验法特异性高、灵敏度高、重复性好,应用于溺死诊断具有较好的应用前景。     

同时鉴定9种肉源种属的复合检测体系的建立及其应用

目的建立一种可以同时鉴定猪、牛、羊、鸡、鸭、猫、狗、鼠和鲤鱼的多重PCR检测方法,并测试其技术性能指标,评估其在法医学或食品安全事件中的应用价值。方法根据上述9种动物的线粒体细胞色素b基因,利用其片段中种间特异性强的序列设计引物,采用毛细管电泳检测平台对各种属PCR扩增产物进行检测,依据扩增片段长度的差异与标记的荧光对初始模板的肉源种属进行鉴别;并通过扩增特异性、实际样本测试、混合样本检测灵敏度等指标评价该方法在实际法医学或食品安全案件中的应用价值。结果经过验证,建立的同时鉴定9种肉源种属的复合检测体系对其中任意一个种属的检测特异性均较高,且灵敏度较强,能够满足绝大多数法医学或食品安全案件中的检测要求。结论本研究建立的肉源种属复合检测体系可以在法医学未知种属样本的鉴定及食品安全肉类掺假等案件中提供帮助。     

应用mtDNA 16S rRNA基因鉴定动物组织种属

目的应用线粒体DNA 16S rRNA基因PCR测序方法进行动物组织种属鉴定。方法未知动物内脏样本8份,已知马鹿、北山羊、绵羊和鹅喉羚肌肉样本各1份作为对照。采用用常规酚-氯仿法提取模板DNA,分别用哺乳动物通用引物和4种已知对照特异性引物扩增16S rRNA基因片段,产物用2.0%琼脂糖电泳检测,并进行序列测定及与基因库已有的序列同源性比对。结果 8份未知样本经哺乳动物16S rRNA通用引物扩增,均检测出阳性条带;用鹅喉羚特异性引物扩增,均检测出阳性特异性条带;用其他3种特异性引物扩增,均未检出阳性条带;未知样本扩增的基因片段经测序及同源性比对,与鹅喉羚的同源性为96%~100%。结论本文未知动物样本均为鹅喉羚内脏组织。本文方法可在动物检材种属鉴定中选用。     

应用mtDNA16S rRNA基因测序鉴定肉产品种属

目的 应用mtDNA 16S rRNA基因测序方法进行肉产品种属鉴定.方法 15份有关部门送检的未知动物肌肉样本,3份市购猪、牛和羊的肌肉为对照样本.常规酚-氯仿法提取模板DNA,分别用通用引物和特异性引物扩增mtDNA的16S rRNA基因片段,产物用1.5％琼脂糖电泳检测,扩增的基因片段由上海生物工程公司进行序列测...     

9色荧光STR复合扩增体系的构建及验证

构建一套包含39个常染色体基因座及Amelogenin性别基因的9色荧光STR复合扩增体系，并验证其在微量与降解检材中的应用效果。根据中国人群核心基因座推荐标准及实际办案需要，筛选出合适的候选基因座，设计引物并以9种荧光染料对其进行标记，构建复合扩增体系并优化；对该体系进行灵敏度、种属特异性、稳定性等确证实验，并通过检验案件样本做进一步评估。结果表明：一套包含39个常染色体STR基因座及Amelogenin性别基因座（其中28个基因座<300 bp）的9色荧光复合扩增体系构建成功。各基因座均衡性良好，灵敏度达0.125 ng，对常见PCR抑制剂具备一定的耐受能力。两性混合样本最低检测比例为1∶4；适用于不同类型案件样本检测，且与市场上其他同类试剂盒比对分型结果一致，种属特异性较好。所构建体系首次采用9色荧光标记技术制成复合扩增试剂，一次性检出基因座数量多，系统效能高；该体系构成以miniSTR为主，对于微量降解检材具有较高的实际应用价值。     

线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定

目的 建立一种用于种属鉴定的线粒体DNA16SrRNA基因和细胞色素b基因荧光标记复合扩增检测体系。方法 利用引物设计软件Primer 5．0对mtDNA序列的16SrRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系,分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物,用310遗传分析仪对产物进行分析。结果 人和5种动物DNA扩增产物均出现两个峰。Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰,为358bp;16SrRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,位于231～256bp之间。结论 该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本,可用于种属鉴定。     

ABO基因分型与多重STR联合检测在法医学中的应用

目的建立ABO基因型和Goldeneye16A试剂盒联合检测的方法,并评价其在法医学实践中的应用价值。方法将6种ABO基因型(A/A,A/O,B/B,B/O,A/B,O/O)的序列特异性引物(PCR-SSP)检测方法与Goldeneye16A试剂盒相整合进行同步分型。通过对460份男性个体血痕样本、9947A DNA及90份案件样本进行检测,考察方法的一致性、灵敏度及对法庭科学检材的适用性。结果应用本文方法可同时检出6种ABO基因型和15个常染色体STR基因座及性别决定基因座,检测灵敏度为125pg,其中ABO基因检测灵敏度达63pg。460份男性血痕和90份案件检材证实该联合分型方法用于各类检材结果准确、稳定。结论本文ABO基因分型与多重STR联合检测方法,适用于各类含有核细胞的生物检材,在法庭科学DNA鉴定中有较好的应用前景。     

线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定

目的建立一种用于种属鉴定的线粒体DNA16SrRNA基因和细胞色素b基因荧光标记复合扩增检测体系。方法利用引物设计软件Primer5.0对mtDNA序列的16SrRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系,分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物,用310遗传分析仪对产物进行分析。结果人和5种动物DNA扩增产物均出现两个峰,Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰,为358bp;16SrRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,位于231～256bp之间。结论该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本,可用于种属鉴定。     

PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用

目的采用PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因,评估其在溺死鉴定中的应用价值。方法 60只实验兔随机分为生前溺死（水中溺毙）、死后入水（空气栓塞致死后入水）、对照组（空气栓塞致死后不做处理）;溺死人体脏器组织;取各组织检材提取硅藻DNA,PCR扩增硅藻特异的核糖体小亚基（SSU）片段,用琼脂糖凝胶电泳检测、DHPLC检测分析。结果 6份硝酸消化法检测阴性的溺死人体器官组织检材经PCR及琼脂糖凝胶电泳检出5例阳性。生前溺死组肺、肝、肾硅藻检出率分别为100%、90%、85%,死后入水组仅肺检出硅藻（15%）,对照组各组织均为阴性;生前溺死组检出率明显高于死后入水组（P〈0.05）。10份溺死人体器官组织检材采用DHPLC法检出硅藻种类明显多于微波消解-扫描电镜法（P〈0.05）。脏器检出硅藻种类与溺死点水样一致。结论采用PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因,有助于溺死鉴定和溺死地点的推断,具有法医学应用价值。     

溺死诊断中浮游生物检验方法的研究现状及进展

法医学实践中,判断是否为“生前溺死”是法医学尸检及鉴定工作中的一个重点和难点,目前尚无能明确诊断溺死的生物学和法庭化学指标。在溺死案件的诊断中,浮游生物检验是常见的方法。尽管目前还存在一些争议,但国内法医工作者认为,器官组织中浮游生物的存在仍然是判断生前溺死的重要证据之一。本文就国内外有关浮游生物的检验方法、检验标准及...     

DYS385检测方法的改进

目的建立检测DYS385的新方法。方法比较基因数据库(GDB)中推荐的引物和Schneider所设计的引物扩增DYS385的效果;在此基础上,以GDB推荐的引物作为外引物,Schneider所设计的引物作为内引物,通过调整内、外引物的浓度,优化扩增条件,建立DYS385的半巢式PCR体系。结果与常规方法相比,采用Schneider所设计的引物扩增DYS385,扩增片段缩短112bp,电泳分离的效果好,灵敏度提高2倍,达500pg;建立的半巢式扩增方法,能特异性扩增短片段,灵敏度提高20倍,达50pg。结论建立的DYS385半巢式扩增方法具有更高的特异性和灵敏度,适合法医学应用。     

A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: Simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes

We developed a novel tool for concluding drowning as a cause of death. We designed nine primer pairs to detect representative freshwater or marine bacterioplankton (aquatic bacteria) and then used real-time PCR with TaqMan probes to rapidly and specifically detect them. We previously cultured the genus Aeromonas, which is a representative freshwater bacterial species, in blood samples from 94% of victims who drowned in freshwater and the genera Vibrio and/or Photobacterium that are representative marine bacteria in 88% of victims who drowned in seawater. Based on these results, we simultaneously detected eight species of bacterioplankton (Aeromonas hydrophila, A. salmonicida; Vibrio fischeri, V. harveyi, V. parahaemolyticus; Photobacterium damselae, P. leiognathi, P. phosphoreum) using three sets of triplex real-time PCR assays and TaqMan probes labelled with fluorophores (FAM, NED, Cy5). We assayed 266 specimens (109 blood, 157 tissues) from 43 victims, including 32 who had drowned in rivers, ditches, wells, sea or around estuaries. All lung samples of these 32 victims were TaqMan PCR-positive including the lung periphery into which water does not readily enter postmortem. On the other hand, findings in blood and/or closed organs (kidney or liver) were PCR-positive in 84% of the drowned victims (except for those who drowned in baths) although the conventional test detected diatoms in closed organs in only 44% of the victims. Thus, the results of the PCR assay reinforced those of diatom tests when only a few diatoms were detectable in organs due to the low density of diatoms in the water where they were found. Multiplex TaqMan PCR assays for bacterioplankton were rapid, less laborious and high-throughput as well as sensitive and specific. Therefore, these assays would be useful for routine forensic screening tests to estimate the amount and type of aspirated water.     

The Diagnostic Value of Quantitative Assessment of Diatom Test for Drowning: An Analysis of 128 Water‐related Death Cases using Microwave Digestion‐Vacuum Filtration‐Automated Scanning Electron Microscopy

The value of diatom test for the diagnosis of drowning remains controversial. The conventional forensic diatom test with low sensitivity is not a useful tool to provide accurate information about diatom in the tissues and organs. To improve the sensitivity of the diatom test, we developed a novel method called the Microwave Digestion‐Vacuum Filtration‐Automated Scanning Electron Microscopy (MD‐VF‐Auto SEM) method which resulted in a high recovery of diatoms. In this article, we analyzed 128 water‐related death cases. Our results showed that the MD‐VF‐Auto SEM method could achieve a much higher positive rate (0.97) in drowning cases. Large amounts of diatoms are retained, even concentrated, in the lung tissues during the intense breathing movement in drowning process. This might be useful for the diagnosis of drowning. Our research indicates that the MD‐VF‐Auto SEM method would be a valuable methodology in the study of diatom test for the forensic community.     

溺死诊断中浮游生物检验方法的研究现状及进展

法医学实践中,判断是否为生前溺死是法医学尸检及鉴定工作中的一个重点和难点,目前尚无能明确诊断溺死的生物学和法庭化学指标。在溺死案件的诊断中,浮游生物检验是常见的方法。尽管目前还存在一些争议,但国内法医工作者认为,器官组织中浮游生物的存在仍然是判断生前溺死的重要证据之一。本文就国内外有关浮游生物的检验方法、检验标准及检验结果的判定等研究现状作一综述,旨在使人们更加清晰地认识浮游生物检验在溺死诊断中的作用。     

A New Method for Human ABO Genotyping Using a Universal Reporter Primer System

Abstract: We developed a new method for forensic ABO genotyping based on a universal reporter primer (URP) system. This allows for the simultaneous detection of six single nucleotide polymorphism (SNP) sites in the ABO gene (nucleotide positions 261, 297, 526, 703, 796, and 803). This URP system provides obvious peaks, ranging from 82 to 151 bp in length. ABO genotypes were classified and successfully genotyped by our method, including minor alleles that may cause a discrepancy between the genetic data and serological phenotypes. Full profiles were identified using as little as 0.1 ng (0.05 ng/reaction) of standard K562 and 9947A DNA. Moreover, the success rate of genotyping from a URP system was much higher than that from a conventional primer extension method in degraded DNA. This method enables simple and rapid detection of multiple SNP sites on human ABO genes and is highly specific and sensitive when using limited and degraded DNA.