检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。     

NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒 (FMDV)非结构蛋白 (NSP) 3ABC多肽作为抗原 ,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验 (I ELISA)。通过对 336份正常牛血清、50 8份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和 58份豚鼠免疫血清的检测 ,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明 ,该方法简易、快速 ,灵敏度比VIAA AGID高     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。     

基于猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN株S1蛋白的基因序列(GenBank:JQ517274)构建哺乳动物细胞重组表达质粒pIRES-S1。利用电转法将pIRES-S1转染至ST细胞,经过G418加压筛选、Western-blot检测、悬浮驯化后,得到能表达S1蛋白的ST稳转细胞池。Western-blot结果显示,S1蛋白具有良好的反应原性。以S1蛋白作为包被抗原初步建立间接ELISA方法,并对PEDV临床血清和进口种猪PEDV阴性血清进行检测,以血清中和试验为标准,结果显示,该ELISA方法敏感性为96.3%,特异性为97.7%,与血清中和试验具有很高的一致性(kappa值=0.882,P0.05)。应用ELISA方法对PEDV返饲猪跟踪血清检测,结果显示,该方法能准确地评估感染猪体内PEDV IgG抗体水平消长规律。上述结果表明,本研究建立的基于S1蛋白的ELISA方法具有高敏感性和高特异性,可用于临床猪血清中PEDV抗体的检测,为猪群PEDV的免疫评估提供有效依据。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE基因在原核表达载体pET-32a(+)中的表达产物,并检测表达产物的生物活性,根据猪流行性腹泻病毒COE基因的全序列设计引物,以pCMV-PEDVCOE质粒作为模板,通过PCR扩增得到COE基因编码区的序列,将其克隆至含有6×His tag的原核表达载体pET-32a(+)中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,以此纯化产物为包被抗原建立了ELISA检测方法,并用该方法对39份感染PEDV猪血清进行了检测。结果显示,COE基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,获得与预期分子质量相符的融合蛋白条带。经Western-blot检测,该蛋白能与Anti-PEDV单克隆抗体发生特异性反应。该融合蛋白纯化、复性后的质量浓度为0.7mg/mL。采用以融合COE蛋白为包被抗原建立的ELISA对39份PEDV感染猪血清的检测结果都为阳性,说明该融合蛋白具备作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法的潜力。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

应用ABC-ELISA诊断实验感染猪旋毛虫病的研究

生物素—亲和素系统(Biotin—Avidin System BAS)是近年来建立的一种新型生物放大系统,它具有高灵敏度,高特异性和高度的稳定性。适用于微量抗体和抗原的检测。本文采用生物素—亲和素与酶联免疫吸附试验相结合的免疫放大作用,将ABC—ELISA技术引入猪旋毛虫病检测,对57头实验感染旋毛虫病猪血清特异抗体及抗体出现的时间进行了检测,其结果如下。     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

猪流行性腹泻病毒S2蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

本研究基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S2截短蛋白,建立了特异性Ig G抗体的间接ELISA检测方法,用于临床PEDV特异性抗体水平的监测。前期筛选了富含中和表位的S2截短基因,体外表达后作为ELISA包被抗原,用于捕获PEDV Ig G抗体,以山羊抗猪HRP-Ig G作为二抗,通过条件优化,建立了检测猪血清中PEDV Ig G抗体的间接ELISA方法。最佳反应条件为:S2抗原蛋白的最佳包被浓度为2μg/m L,临床血清样品和酶标二抗的最佳稀释倍数分别为1∶400和1∶20 000。该方法的批内和批间重复变异系数(CV)分别为1.81%～8.52%和1.18%～7.41%,重复性较好;该方法检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清时结果均为阴性,特异性较强。该方法与商品化PEDV抗体检测试剂盒相比较,阳性符合率为95.18%,阴性符合率为91.43%,说明该方法可用于临床血清抗体筛查。进一步利用此方法对324份猪的临床血清样品进行检测,发现PEDV抗体阳性血清占62.96%,与临床现状基本吻合。上述结果表明,该方法适用于临床猪群中PEDV Ig G抗体水平普查,为PEDV的疫病防控及灭活疫苗评价提供了有效的技术支持。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV218bp片段的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV标准毒株OregonC24V中扩增出了218bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID50。不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。表明,建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

表达CPB-ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌β毒素（ＣＰＢ）和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白（ＣＰＢＳＴ）的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工程菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠，攻毒试验结果表明，免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株（Ｃ５８－１）和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。用灭活的全菌体免疫家兔后，其免疫血清能中和产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ的毒素活性。结果表明，构建的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）可以作为预防由产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ引起的幼畜腹泻的基因工程苗侯选菌株。     

H3N2亚型猪流感病毒核蛋白基因的优化表达及抗原性分析

根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

The Arsenal of Insurrection: Explaining Rising Support for Rebels

Recent scholarship has established several key dynamics in civil wars: since the nineteenth century, rebel victories have increased in likelihood; external support is one of the most significant predictors of rebel victory; and rebel groups have become increasingly likely to receive foreign backing. What is missing is an explanation of why patterns of third-party aid to rebels changed over time. Data on foreign assistance to rebels over the last two centuries reveals the odds of groups receiving aid increased from about one in five to about four in five. The nature of the patron also altered significantly, from great powers, to lesser states, and then nonstate actors. We explain these patterns using three variables: (1) great-power competition; (2) norms of national self-determination; and (3) globalization. This paper explores this theory with a case study of aid to rebel groups in Algeria since the 1830s.     

猪肺炎霉形体膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

通过提取猪肺炎霉形体ATCC25095株膜蛋白,并用免疫亲和层析柱对膜蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析得到了分子质量分别为66、50、46、42、32和24 ku的6种膜蛋白。以纯化的膜蛋白为包被抗原,建立了检测猪肺炎霉形体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,纯化的抗原具有更好的重复性和敏感性,对临床检测样品的检出率高于IDX ELISA试剂盒。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。