大熊猫轮状病毒CH-1株NSP4基因的克隆与生物信息学分析

用MA-104细胞增殖大熊猫轮状病毒(RV),并提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得NSP4基因,将其克隆到载体进行测序,应用生物信息学方法初步分析NSP4基因的结构及功能,并与不同动物的RV构建系统进化树。结果显示,获得了长750bp的大熊猫RVNSP4基因,此序列包含1个528bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫RVNSP4基因的理论分子质量为20223.7u,等电点为6.84,半衰期为30h,不稳定系数为30.40,总平均亲水性为-0.240,疏水性为-2.400～2.622;无信号肽序列;跨膜结构分析表明,NSP4有1个跨膜区,其N端位于病毒膜外区,C端位于病毒膜内区;抗原表位预测显示,NSP4有6个抗原决定簇;结构预测显示,其可能包含2个N-糖基化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化作用位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点;系统进化树分析显示,大熊猫RV NSP4基因与猪RV NSP4基因的进化距离最近。     

大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的GPRV VP1蛋白基因(GenBank登录号:HQ641297);经生物信息学分析,此序列包含有一个3 267bp的完整开放阅读框,编码1 089个氨基酸;无信号肽;无跨膜区,其整个蛋白都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP1蛋白有41个抗原表位;系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因与猪A组轮状病毒VP1基因的进化距离最近。本研究成功获得了大熊猫源RV VP1基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

狂犬病病毒aG株G基因的克隆与生物信息学分析

为了研究狂犬病病毒aG株的进化情况,分析狂犬病病毒的遗传变异和基因功能,采用BHK-21细胞培养繁殖狂犬病病毒aG株,运用RT-PCR扩增G基因,将其与pMD18-T simple vector连接后转化JM109感受态细胞,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,狂犬病病毒G蛋白基因全长1 575bp,包含1个阅读框(ORF),编码524个氨基酸。生物信息学分析表明,G蛋白的分子质量为58 377.22u,理论等电点为7.080,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为42.99,脂肪指数为88.45,总平均亲水性为-0.106,最大疏水性为3.489,最小疏水性为-2.600,信号肽序列为1～19位氨基酸残基,跨膜区结构分析显示该蛋白为跨膜蛋白,预测可能包含有4个N-糖基化作用位点,2处基于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,13处蛋白激酶C磷酸化位点,12处酪蛋白Ⅱ磷酸化位点;1处酪氨酸激酶磷酸化位点;9处N豆蒄酰化位点;1个酰胺化位点。系统进化分析表明,aG株G蛋白与DRV株进化距离最近。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF83基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF83蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF83基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF83基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长687 bp的ORF83基因,编码229个氨基酸;编码蛋白的理论分子质量为25 822.18 u,等电点为8.600;疏水性为-2.733～3.100;信号肽切割部位最可能位于第22位的G(甘氨酸)和第23位的V(缬氨酸)之间;跨膜结构分析表明,ORF83有4个跨膜区;抗原表位预测显示,编码蛋白的抗原性良好;结构预测显示,ORF83可能存在1个N-糖基化位点、11个O-糖基化位点和13个磷酸化位点;系统进化树分析显示,KHV-CJ株与锦鲤疱疹病毒美国株和以色列株属同一分支。结果表明,ORF83基因编码的蛋白可能具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

口蹄疫病毒A/WH/09株结构蛋白P1基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

对口蹄疫病毒(FMDV)A/WH/09株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果显示,FMDV A/WH/09株P1基因长2 208bp,包含完整的开放阅读框,编码736个氨基酸,其中VP1长636bp,编码212个氨基酸;VP2长654bp,编码218个氨基酸;VP3长663bp,编码221个氨基酸;VP4长255bp,编码85个氨基酸。采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行了综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布。结果表明,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞抗原优势表位,VP4上也有少量潜在的B细胞抗原表位。与已鉴定的B细胞抗原表位相比,本试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法。     

弓形虫profilin蛋白基因的克隆表达及序列分析

为研究弓形虫profilin(prf)蛋白基因的遗传变异规律和表达产物的反应原性,以9个来源于不同宿主和地方的弓形虫虫株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增该基因并测序。将测序结果与从ToxoDB网站下载的4株弓形虫序列一起进行比对分析,用最大简约法绘制系统发育树。再以弓形虫RH株虫体总RNA为模板,使用RT-PCR方法扩增prf基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化入表达菌BL21(DE3)后,使用IPTG进行诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。同时,将弓形虫RH株prf基因编码区序列翻译成氨基酸序列,利用生物信息学软件对其亲疏水性、跨膜结构域、二级结构及B细胞抗原表位进行分析。结果显示,9个弓形虫虫株的prf基因长度均为3 552bp,一致性大于99.5%。系统发育树分析表明,弓形虫虫株的聚类没有规律。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,Profilin蛋白的分子质量约为30ku,且反应原性较好。蛋白结构预测结果显示,该蛋白含有4个亲水区,无跨膜区,7个α螺旋,8个β折叠,4个β转角,2个无规则卷曲和7个线性B细胞抗原表位。本研究结果表明,弓形虫prf基因可作为抗弓形虫疫苗候选分子。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因侧翼序列的hiTAIL-PCR扩增及其生物信息学分析

为扩增环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的侧翼序列,从感染环形泰勒虫的淋巴细胞系中提取RNA,反转录合成第1链cDNA。以该cDNA为模板,利用高效热不对称交互PCR法(hiTAIL-PCR)进行扩增,将目的片段连接到pGEM-T Easy载体并进行测序。结果显示,获得了环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的5′端侧翼序列,该序列编码894个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有信号肽,信号肽剪切部位位于第19~20个氨基酸残基之间,很可能是一种分泌蛋白;经TMHMM2.0预测,该蛋白在第875~892位氨基酸残基部位具有典型的跨膜结构;Motifscan预测的结果显示,环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白存在2处N-糖基化位点(153NLSF、333NESM)和15处CK2蛋白激酶磷酸化位点;在该蛋白第500~650位氨基酸残基部分具有较高的抗原性,推测可能是该蛋白与其他蛋白发生相互作用的区域。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

己烯雌酚人工抗原的合成研究

采用三步反应合成了己烯雌酚人工抗原 ,为己烯雌酚酶免疫检测技术的进一步研究奠定基础。试验结果证实 ,己烯雌酚及其衍生物存在着顺反异构转化现象 ,酸碱处理是降低交联前衍生物中顺式体比例的有效方法 ;经三步合成 ,成功地制备出了人工抗原 ;人工免疫原及包被原的最适结合比例分别为 1∶2 8和 1∶7。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

六部门动态优化模型在吉林老工业基地产业结构优化升级中的运用

产业结构问题是我国当前亟须解决的重大问题,产业结构的优化升级是经济均衡增长的关键。在相关理论方法还不够完善的背景下,构建适合国情的产业结构动态优化的理论与方法,为我国的结构调整提供有价值的参考,将具有深远的理论与实践意义。产业结构动态优化模型体系与吉林省的实证研究相结合,可以发挥区域优势,以科技进步促进产业的结构升级,解决供需结构失衡的深层矛盾。     

γ-氨基丁酸对离体培养牦牛黄体细胞凋亡的影响

用离体培养方法观察了γ 氨基丁酸 (GABA)对牦牛黄体细胞凋亡及羟自由基 (OH )生成的影响。结果表明 ,GABA能促进黄体细胞OH的生成并诱导黄体细胞凋亡。     

日本对华援助(ODA)政策调整的原因分析

日本对华援助是在中国放弃日本战争赔款和国际形势发生重大变化、要促进中日两国和平友好相处的背景下产生的,20多年来,日本对华“援助”在中国大地的改革开放过程中,谱写了中日友好的新篇章。但是,近年来,由于国际形势和中日两国国内情况的变化,中日关系在逐步倒退。日本开始改变初衷,即对华援助从过去的以经济利益为目的转向以政治利益为目的。日本对华ODA政策作了大幅调整,“援助”金额逐渐减少,而且,日本政要多次表示对华经援“总有一天要毕业”。日本方面出现了与初衷不同的做法,给两国关系正常化带来了不利的影响。