微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建与分析

以我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺cDNA为检测子Tester),饥饿雌性成蜱cDNA为驱动子(Driver),采用抑制消减杂交技术和T/A克隆技术构建了微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库。对获得的158个阳性克隆进行PCR鉴定,显示插入片段主要集中在200~550bp之间,挑取60个阳性克隆进行测序,共获得了14个有效ESTs,生物信息学分析推测,它们所编码的功能性蛋白包括卵黄蛋白原、基质蛋白、富含脯氨酸蛋白质、OTM-3假定蛋白等。根据基因序列设计引物,以微小牛蜱DNA为模板,对所得ESTs进行鉴定,证明它们都是微小牛蜱所固有的。该项工作为进一步研究微小牛蜱唾液腺差异表达基因奠定了基础。     

猪水泡病病毒与口蹄疫病毒引起寄主细胞(组织培养的肾细胞)病理过程的超微结构研究

据报导,近年在意大利和英国流行的一种新的猪水泡病病原体,认为是一种属于肠道类的病毒。对提纯病毒的电子显微镜观察说明,是直径为30～32毫微米的球状病毒(1、2)。我们用超薄切片技术,对国内某地流行的猪水泡病病毒在寄主细胞内的分布,晶格排列与形态也进行了电子显微镜观察,是直径为22～23毫微米的近似球形的病毒(3)。在前一阶段工作的基础上,我们继续研究了猪水泡病病毒引起寄主细胞(组织培养的肾上皮细胞)病理过     

马焦虫病传播者——草原革蜱的生物防治研究——蜱经钴~(60) 处理后在兔体的有效不育剂量试验

蜱类是吸血的节肢动物,可以传播多种病原体,对人畜健康危害很大。目前对蜱的驱杀多采用化学杀虫剂。它对有机体虽有广谱的毒杀作用,但也能杀死害虫的天敌,造成生态平衡严重失调。因此,生物防治的方法越来越受到重视。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

蜱的免疫学防制研究现状

蜱及其传播的疾病是倍受全球医学界和兽医学界关注的公共卫生问题。蜱的直接感染和其传播的疾病常常造成巨大的经济损失。为了解决多年来只依赖化学药物防治蜱及其传播的疾病所造成的抗药性及药物残留和环境污染等问题 ,许多科学家一直为蜱的免疫学防制孜孜以求。蜱的免疫学防制主要是开发抗蜱疫苗 ,而在疫苗开发的各个环节中 ,功能性抗原的选择起着举足轻重的地位。1　抗蜱免疫的机理蜱 宿主 病原间存在着复杂的免疫反应。其一 ,蜱及其传播的病原体对宿主的免疫。蜱通常主要通过绕行、偏离或者抑制等手段来支配宿主的免疫防御系统。由蜱传…     

莱姆病研究进展

莱姆病(Lyme Disease)又称蜱性螺旋体病、蜱性红斑、移行性红斑和环形红斑。1974年夏天,美国东北部康涅狄格州莱姆镇(Lyme)的一群儿童患有一种类似风湿性关节炎的疾病,在对12000人的检查中发现39例儿童和12例成人患有此病。自此,以发病地镇名命名为莱姆病,由当时耶鲁大学医学院的A.C.Steere作了首次描述。1982年Brugdofer博士从达敏硬碑(Ix-odes dammini)中分离到一种疏螺旋体并进一步证实其为莱姆病的病原体。1984年将此病原体命名为伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)。     

miR-275在长角血蜱不同发育阶段及组织中表达的动态变化

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。     

基于ITS和COⅠ基因对于我国璃眼蜱的分类研究

为了重建我国璃眼蜱的分类地位,厘清一些分类争议,首次将ITS和COⅠ作为标记基因进行璃眼蜱的分类研究。从新疆、甘肃、内蒙古等地共收集到7种璃眼蜱样品,提取样品基因组后,以ITS和COⅠ为目的基因进行扩增,将测序结果与GenBank中其他相关序列进行相似性比对及系统进化分析。结果,从样品中扩增到ITS基因序列长度为2 925~3 121 bp,COⅠ基因的长度为707 bp;基于ITS和COⅠ基因对我国璃眼蜱的分类结果显示,盾糙璃眼蜱与残缘璃眼蜱为同物异种,边缘璃眼蜱与麻点璃眼蜱为2个独立种,亚洲璃眼蜱与亚东璃眼蜱是否为亚种关系还需进一步研究证实。     

波斯锐缘蜱的形态学和分子标记特征

为了精准鉴定波斯锐缘蜱,从新疆、甘肃、河北等地采集寄生蜱,借助体视显微镜超景深系统对其形态学特征进行观察;经PCR扩增、测序获得其16S rDNA和cox1基因序列,结合GenBank数据库中参考序列,比对分析同源性并构建系统进化树。结果显示,波斯锐缘蜱幼蜱形态与其他发育阶段差异较大,其体型较小,背、腹表面光滑,无盘窝,生殖孔未形成,足3对。若蜱除生殖孔不显著外,其他形态结构均与成蜱相似。雌、雄成蜱形态学差异主要为:雌蜱生殖孔呈横裂形,雄蜱生殖孔呈半圆形。同时,在16S rDNA和cox1基因序列的邻位相接系统进化树中,波斯锐缘蜱分布于两大进化枝之一的软蜱科,同种聚类良好。结果提示:波斯锐缘蜱具有显著、易辨识、易鉴定的形态学和分子标记特征。     

人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒猪脑组织的转录组学分析

运用Illumina高通量测序技术对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的猪脑组织进行RNA-Seq测序,试图分析感染PRRSV的猪脑组织中炎症相关基因以及炎症信号通路的作用。结果显示,PRRSV进入脑组织引起炎症反应,镜检观察发现有大量的淋巴细胞浸润、血管袖套的形成、神经元坏死等非化脓性脑炎的典型病理变化。对转录组测序结果进行分析,发现了一些与炎症紧密相关的基因如TNF-α、CCL2、CXCL9、CXCL10、CCL11等差异性表达,与炎症紧密相关的通路如NF-κB通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、细胞因子受体相互作用等被激活,提示这些基因和通路均参与了PRRSV感染后脑组织的病理学变化过程。     

祁连山北麓铧尖地区莱姆病自然疫源地调查研究

在调查、访问和体检的350人中,发现莱姆病典型患者13例; 检查人血清279人份,检出抗体阳性率11.11％;检查牦牛血清99头份,检 出抗体阳性率70.71%;调查动物及鸟类80余种,其中以旱獭、野兔和鼠 类占居优势;调查吸血昆虫五类,其中以蜱和虻类占居优势;景观为山地,其中以干旱草原、草甸草原、灌丛草原和森林草原四类生境为主;从四类生境采集不同类型样本108组作了接种培养,仅从森林革蜱(Dermacentor silvarum)体内分离出伯氏螺旋体。基于上述,该地存在莱姆病自然疫源地。     

豪猪血蜱的形态学和分子生物学鉴定

为豪猪血蜱的鉴定提供准确依据,从湖南省怀化地区猪獾体表采集蜱,运用体视显微镜超景深系统观察其形态学特征;提取蜱体壁总DNA,经PCR扩增测序获得其COX1、ITS2和16SrDNA基因序列,与GenBank数据库中序列比对,并构建系统发育树,进行同源性分析.结果显示,该蜱种雌蜱呈南瓜子形,前窄后宽;假头基为矩形,基突后...     

牛脊柱畸形综合征HRM-非标记探针检测方法的建立与应用

为建立用于牛脊柱畸形综合征(CVM)检测的高分辨率熔解曲线(HRM)非标记探针法,根据Gen Bank中SLC35A3基因序列设计PCR引物及非标记性探针,构建G/G型、G/T型、T/T型3种标准质粒,利用质粒作为标准品建立HRM特征图谱。采用优化的HRM-非标记探针法对305份荷斯坦奶牛血样及冷冻精液样品中SLC35A3位点的基因型进行检测,同时采用测序法进行验证。结果,305份样本中9份冻精样本为CVM携带者,携带率为2.95%,检测结果与测序法检测结果一致,准确率达100%。上述研究结果表明,本研究建立的针对牛CVM中SLC35A3基因G-T位点突变检测的HRM-非标记探针方法是一种简单快速、灵敏特异、高效准确的牛CVM有害基因分型检测技术。     

聚合酶链技术在莱姆病蜱传播途径研究中的应用

采用聚合酶链技术（ＰＣＲ）对采自甘肃省肃南县皇城区的草原革蜱进行了伯氏疏螺旋体传播途径的研究。结果，从３６组草原革蜱的成蜱标本中检测到９组阳性，阳性率为２５．０％；从３２组幼蜱中检测到７组阳性，阳性率为２１．９％；从８组蜱卵中检测到２组阳性，阳性率为２５．０％；还从蜱叮咬的１４份羊皮肤红斑组织中检测到６份阳性，阳性率为４２．８％，从而证明草原革蜱是该地区莱姆病的传播媒介，既可水平传播，也可垂直传播     

山羊关节炎脑炎的免疫电镜观察

山羊关节炎脑炎(Caprine Arthritis En-cephatitis,简称CAE)是山羊的一种慢性传染病,其病原体为CAE病毒,属于逆转录病毒科中的慢病毒亚科,为单链的RNA病毒。我们已在国内首次从进口奶山羊分离出CAE病毒(见《中国兽医科技》1989,10,3～4页);本试验运用免疫电镜技术对CAE病毒颗粒形态结构进行了观察。     

不同抗体对青海血蜱唾液腺蛋白组分的识别差异

通过利用青海血蜱唾液腺蛋白皮下注射绵羊和将蜱在绵羊体直接饲喂2种免疫途径制备了2种阳性血清。利用这2种阳性血清分别与青海血蜱唾液腺天然蛋白进行免疫学反应,结果显示青海血蜱唾液腺中分子质量为22 ku和37 ku的2种天然蛋白能被利用蜱唾液腺蛋白皮下注射绵羊产生的阳性血清所识别,而不能被蜱叮咬的绵羊的阳性血清所识别。结果表明,在蜱正常叮咬宿主动物时,其唾液腺内的某些组分不与宿主的免疫系统相互作用,但这些组分具有免疫原性。     

日本血蜱和嗜群血蜱成虫哈氏器的扫描电镜观察

哈氏器是蜱类第一对足背面的化感器,据报道,它的超微结构可作为分类的依据。本文报道用扫描电镜对日本血蜱和嗜群血蜱成虫的哈氏器观察结果,旨在找出可作为分类的特征。 (一)材料和方法 将经75％酒精固定的日本血蜱、嗜群血蜱标本,用磷酸盐缓冲液在超声洗涤器中洗涤后,分别依次用80％、90％、95％及无水酒精逐级脱水,之后用导电胶将其固定在样本台上,用I.B3型离子喷涂仪镀金,即可作为扫描标本,用日立S—760型扫描电镜观察并摄影。加速电压为15KV。 (二)观察结果     

表达序列标签在寄生虫基因研究中的应用

一个基因组的所有碱基中大约只有 2 %组成编码蛋白质的那部分基因 ,因此 ,测序基因组已不再是一种创建基因目录的有效途径。大量的试验证明 ,以cDNA的形式进行基因转录产物的大规模测序是了解基因组的首选办法。高通量cDNA测序于 1991年由Adams等[1] 创始 ,在构建人脑的cDNA并进行末端单向一次自动测序时首次提出了“表达序列标签 (EST )”概念 ,并发现了 337个基因。EST是对随机挑取的cDNA克隆的外源插入片段的一端或两端进行一次性测序产生的DNA序列 ,长度一般为 30 0～ 5 0 0bp ,一个全长基因转录本的cDNA序列可能包含多个重叠…     

蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒半巢式PCR检测方法的建立

为建立快速、敏感的蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)检测方法,根据GenBank中已登录的蜱源LCMV NP基因序列设计半巢式PCR引物,通过优化反应条件建立半巢式PCR检测方法。结果显示,用该方法能扩增出248 bp的目的片段,与LCMV序列(MG554174)的同源性为100%。特异性试验结果显示,该方法对蜱传脑炎病毒、发热板血小板减少综合征病毒、阿龙山病毒的基因扩增无条带。敏感性试验结果显示,该方法最低可以检出0.45×10~2copies/μL的蜱源LCMV NP蛋白基因,是普通PCR的1 000倍。对总数为150只森林革蜱、草原革蜱和全沟硬蜱样品的检测发现,半巢式PCR、普通PCR的检出率分别是18%和0。蜱源LCMV半巢式PCR方法的建立为蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎的防控提供了技术支持。     

犊牛摘脾术的发展现状

摘脾术已广泛应用到某些蜱媒疾病的研究和防制技术中,如在摘除脾脏的动物体内繁殖边虫(Anaplasma)、巴贝斯虫(Babesia)、附红小体(Eperythrozoon)等病原体,供制备诊断液或疫苗。澳大利亚蜱热病研究中心(TickFever Research Centre)是一个具有40年历史的专业研究机构,1956年开始用摘脾牛研制巴贝斯虫病和边虫病的诊断制剂和疫苗。1986年增添了一