山羊鼻内肿瘤病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV)SC株的基因序列,设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测ENTV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RTPCR扩增,能得到与理论设计值大小相符的323bp的特异性条带;与ENTV-SC株相应序列的同源性达98%;该方法最低可检测出6pg的ENTV;用此方法对健康山羊鼻黏膜上皮、健康牛鼻黏膜上皮、绵羊肺腺瘤病毒、肺炎球菌和大肠杆菌的扩增结果均为阴性,重复性和稳定性好;对随机收集的100份山羊样品进行检测,并与临床诊断结果进行比较,符合率为100%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性均好,可用于山羊鼻内肿瘤病毒的临床检测和试验研究。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

犬瘟热病毒PS株的全基因组序列测定与遗传进化分析

对犬瘟热病毒(CDV)PS株基因组进行全基因组序列测定与分析,以阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。利用RT-PCR方法分段扩增PS株全基因组序列,分别将产物克隆入pMD18-T载体中并进行测序,将所测序列拼接获得CDV PS株的全基因组cDNA。用DNAStar软件比较PS株全基因组序列与国内外犬瘟热病毒疫苗株和野毒株全基因组序列的同源性,然后用Mega4.0软件进行系统进化分析。测序结果显示,PS株全基因组序列的长度为15 690nt,该基因组推导的某些氨基酸位点发生了突变。与GenBank中登录的国内外参考毒株的同源性比较结果显示,PS株基因组与MKY-KM08分离株的基因序列同源性高达97.9%,与其他毒株的同源性为93.0%～97.0%;与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为疫苗株和野毒株2支,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。结果表明PS株为野毒株,其全基因组序列与MKY-KM08株的全基因组序列亲缘关系最近。     

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp）特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列，经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标，设计引物92.1F/R，采用普通PCR体系检测4株Mccp（1801、1601、1309F、Zly-14）和7种其他支原体基因组DNA，包括无乳支原体（Ma）PG2、丝状支原体山羊亚种（Mmc）PG3、Mmc YG（前称丝状支原体丝状亚种大菌落型，MmmLC）、绵羊肺炎支原体（Mo）Y98、山羊支原体山羊亚种（Mcc）Ckid、牛支原体（Mb）08M、李奇氏支原体（Ml）PG50，并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA，评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带，证实该引物可用于检测Mccp，92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标，为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。     

伪狂犬病病毒gG-gD基因片段的扩增及克隆和序列测定

以伪狂犬病病毒(PRV)HB-9304株的基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)对其gG-gD基因片段进行扩增,获得了预定大小的片段,将这一片段克隆到质粒载体pPK中.对重组质粒pPKGD进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定,证实了克隆片段的可靠性.     

广东省新兴县鸭圆环病毒感染的PCR诊断及序列分析

根据已发表的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列,合成了1对检测引物.利用此对引物对广东省新兴县发生的疑似圆环病毒感染的患病番鸭的肝、胰腺、心、肾、脾、肺、血液、腔上囊、胸腺、哈氏腺、粪便和羽毛进行了PCR扩增.结果显示,获得了与预期619 bp大小相符的DNA片段,经测序确认其为DuCV特异序列,证实鸭群感染了鸭圆环病毒.然后,再设计了2对引物从鸭组织提取的DNA中扩增出2条片段,拼接校对后获得了全基因组序列,并对其进行了分析.结果表明,在感染鸭体内各组织器官中都有DuCV存在,该株病毒基因组序列全长为1 988 bp,与部分已登录GenBank的DuCV同源性高达97.0%以上.     

应用PCR等核酸技术检测动物饲料中牛羊组织成分

为准确鉴别不同品种动物源性饲料,防范疯牛病及羊痒病的传播,建立了检测牛、绵羊和山羊组织种间特异的聚合酶链反应(PCR);用Mbo I、Vsp Ⅰ、Rsa Ⅰ分别对从动物饲料中检测得到的牛、绵羊和山羊组织的PCR产物进行酶切分析,酶切图谱与序列结构相符;核酸测序结果表明,3种动物组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合.用3种检测方法检测牛、绵羊和山羊组织无交叉反应,检测猪、鸡、兔和鱼等动物组织均呈阴性.PCR检测的敏感性可达0.25%(质量分数),PCR检测全过程包括样品处理,可在3 h内完成.     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)SC株S1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。     

猪戊型肝炎病毒广西株ORF2三段连续基因编码蛋白的表达及抗原性分析

为了确定猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2抗原性片段的分布,参考中国T1株序列设计套式引物,从新鲜猪粪中扩增出HEV部分基因片段,长1725bp,位于ORF2第205～1929bp之间,命名为HEVORF2-A。根据HEVORF2-A序列设计了3对引物,分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段,命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3,分别位于HEVORF2-A第1～576bp,577～1149bp,1150～1725bp之间。将这4段扩增的基因片段分别与表达载体pET32a(+)连接,并转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,经1mmol/LIPTG37℃诱导6h后,除pET32a-A在82.6ku处有微量融合蛋白表达外,pET32a-B1、pET32a-B2、pET32a-B3分别在41.3ku、41.5ku、41.8ku处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行Western-blot分析,结果3个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明构建的3个表达载体具有良好的抗原性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

丝状霉形体丝状亚种SC型脂蛋白LppQ基因的序列分析

根据基因库发表的丝状霉形体丝状亚种SC型 (MmmSC)脂蛋白LppQ基因序列设计引物 ,采用PCR对国内MmmSC分离株HVRI X株的脂蛋白LppQ基因进行扩增 ,将扩增产物与pMD18 T载体连接并测序。核苷酸序列比较结果显示 ,HVRI X株的LppQ基因序列与基因库发表的核苷酸序列同源性为 99.8% ;由其推导的氨基酸序列同源性为 99.3%。     

天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的多态性分析

为分析天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法检测了698头天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆、测序。结果显示,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子有AA、AB和BB 3种基因型,其基因型频率分别为0.892 6、0.106 0和0.001 4,由A和B 2个等位基因控制。序列分析表明,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子在41bp处发生了A→G突变,但并未导致编码氨基酸序列发生改变。统计结果表明,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子呈低度多态。     

猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析

为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。